(论述蛋白质间相互作用.docxVIP

蛋白质间相互作用技术概述摘要:通过研究蛋白质- 蛋白质的相互作用, 能够更好地注释蛋白质功能, 解码生命现象。蛋白质相互作用研究方法的快速发展与不断完善为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。本文对当前研究蛋白质相互作用的主要技术方法, 包括酵母双杂交技术,免疫共沉淀技术、蛋白质亲和层析等多种研究方法进行综述。关键词:蛋白质; 蛋白质相互作用; 蛋白质功能1.前言蛋白质间相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中, 生物学中的许多现象如复制、转录、翻译、剪切、分泌、细胞周期调控、信号转导和中间代谢等均受蛋白质间相互作用的调控有些蛋白质由多个亚单位组成, 它们之间的相互作用就显得更为普遍. 有些蛋白质结合紧密, 而有些蛋白质只有短暂的相互作用. 然而不论哪种情况, 它们均控制着大量的细胞活动事件, 如细胞的增殖、分化和死亡. 通过蛋白质间相互作用, 可改变细胞内蛋白质的动力学特征, 如底物结合特性、催化活性; 也可产生新的结合位点, 改变蛋白质对底物的特异性; 还可失活其它蛋白质, 调控其它基因表达. 因此,只有使蛋白质间相互作用顺利进行, 细胞的正常生命活动过程才有保障. 由于蛋白质间相互作用具有如此重大的意义, 因此其检测方法的研究也备受重视. 由生化方法, 如蛋白质亲和层析( protein af f initychromatography ) 、亲和印迹( affinityblot ting ) 、免疫沉淀( immunoprecipitat ion) 及交联( cross-linking ) ,发展到当今的分子生物学方法, 如以基因文库为基础的蛋白探测( protein probing ) 、噬菌体显示( phag e display ) 及双杂交系统( tw o-hybr id sy stem) 等. 另外, 还发展了可定性和定量检测蛋白质间相互作用的简便又快捷的方法, 如表面胞质团共( surfaceplasmonresonance) 等. 通过这些方法的联合使用,由实验得出的蛋白质间相互作用的结论显得更为可靠分子生物学方法尤其是双杂交系统的建立, 使发现新蛋白质的方法更为简捷.2.酵母双杂交技术1989年, Fie lds[2] 根据转录激活因子GAL4的特性建立了酵母双杂交技术, 用于研究蛋白质- 蛋白相质的相互作用。转录激活因子GAL4 的N 端是DNA 结合域( DNA binding dom a in,DNA- BD) , 可以与DNA分子的上游激活序列结合; C 端是转录激活域( activationdom a in,AD), 用于激活下游基因的转录。当DBD与AD结构域在细胞内充分接近时, 呈现GAL4转录因子活性启动下游基因的转录过程, 而两个结构域单独分别作用不能够激活完整转录反应。在酵母细胞内将诱饵蛋白与猎物蛋白的核酸序列分别同DNA - BD和AD的核酸序列融合表达, 如果目的蛋白在细胞内存在相互作用, 则转录激活因子GAL4启动报告基因的转录表达, 通过被调控表达的半乳糖苷酶的活性检测目的蛋白相互作用关系。酵母双杂交系统在蛋白质- 蛋白质相互作用研究方面, 具有非常高的灵敏度, 特别是在用于研究蛋白质间微弱的、瞬时的相互作用时都能够通过报告基因的表达产物敏锐地进行捕获。Reddi等[3]利用酵母双杂交技术研究肝炎B 病毒反式作用因子HBx蛋白,结果表明H Bx蛋白可以通过其C 末端区域产生自我偶联作用。Shi Y等[4] 2009年利用酵母双杂交系统从分子水平研究了酪蛋白激酶2( CK2)与有丝分裂原和应激活化型蛋白激酶(MSK1) 的相互作用关系。发现MSK1蛋白既与CK2调节亚基相互作用, 也与CK2催化亚基相互作用; 而CK2催化亚基只与MSK1蛋白C 端激酶区相互作用。人们在利用酵母双杂交技术进行蛋白质相互作用研究中,也同时发现酵母双杂交技术存在不足。一是要求发生相互作用蛋白在细胞内的定位较严格, 对于存在于胞浆内、细胞膜和通过分泌泡分泌到细胞外的蛋白, 酵母双杂交均不能检测; 二是融合表达蛋白存在着影响目的蛋白折叠和修饰不确定性, 特别是在研究异源蛋白相互作用时, 融合表达蛋白如果不能正确折叠和修饰, 则影响蛋白的活性, 干扰蛋白质相互作用。3.免疫共沉淀技术(co-immunoprecipitation)免疫共沉淀是确定蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效技术,是利用抗原抗体的特异性结合特点来鉴定蛋白质相互作用的方法。在非变性温和条件下裂解细胞,可保持细胞内蛋白质间的相互作用, 再加入诱饵蛋白抗体产生免疫沉淀反应, 则与诱饵蛋白稳定结合的猎物蛋白也共同沉淀下来, 再通过电泳分离、质谱鉴定具有相互作用的猎物蛋白。Operana等[5] 利用免疫共沉淀技术研究UGT1A蛋白之间的相