柱层析培训解析.ppt

柱层析培训SundiaXie Lihua 2012 谢谢！ * 柱层析的原理 硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般悄况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。 主要步骤 一、估算和称量硅胶。 二、选柱子， 三、装柱 四、上样。 五、过柱和收集。 六、检测。 七、样品最后处理。 一、估算和称量硅胶。 200 一 300目硅胶，称 15 一 30倍上样量；这个比例不是绝对的，如果是很好分的样品，比例可以更低，如果是很难分的样品，比例还可以更高，如果极难分，也可以用 50 倍量硅胶H。但超出50就没有太大意义了。干硅胶的视密度在 0 . 4 左右，所以要称 40g硅胶，用烧杯量 100ml 也可以。 二、选柱子。 柱子的大小是根据硅胶的用量决定的，硅胶的用量又是由样品的性质和数量决定的，其次就是柱子应该装多高，通常柱子的高度是根据它的直径来决定的，大约柱高：柱直径的比例是1:6—1:10，这个比例也不是绝对的，好分的样品可以用短粗的柱子，高/径比例就低，难分的要用细长的柱子，高/径比例就高些，但也不是越高越好，太高了，过柱时间太长，无序扩散厉害，反而分离效率低。有了以上的两条，基本上就可以算出来要选用什么尺寸的柱子了 三、装柱。有干法装柱和湿法装柱两种 真空干法装柱： 在色谱柱下端接上真空，把干的硅胶一次性直接倒入干净的色谱柱，轻轻拍打柱身使柱子结实、上端面平齐，然后再加装石英砂。再小心加注过柱起始洗脱配比的溶剂。这时候溶剂会被真空快速吸到柱子下端，此时一定要保持真空不能松懈，否则功亏一篑。直到有溶剂流出后，就可以关闭柱子的下阀门，再拔掉柱子下的真空，让柱子内部的压力自动平衡。注意溶剂液面，千万别让柱子干掉。平衡后，压掉多余的溶剂（液面压到与石英砂平齐），就算装好了。 三、装柱。有干法装柱和湿法装柱两种 湿法装柱： 先要把干硅胶搅成匀浆，具体做法是加入干硅胶体积一到两倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌，如果洗脱剂是石油醚／乙酸乙酯／丙酮体系，就用石油醚：如果洗脱剂是氯仿／醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂太少或者其中含水量太大，尤其是用乙酸乙酯／丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1 % 醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。 然后如果是小柱子装上蓄液球，打开柱下活塞，保持柱子通畅，把硅胶与低极性溶剂混合的悬浊液（硅胶溶剂比约1:1~2）倒入柱子将匀浆一次倾入蓄液球内。然后轻轻敲打柱身使混入的气泡自然排出。然后随着沉降，会有些硅胶沾在蓄液球内．最后用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。如果柱子比较大，敲打柱身一般是排不出气泡的，还需要用干净的搅棒，轻轻朝一个方向慢慢搅动，以利于气泡的排出。如此反复几次，再用装柱溶剂把柱子压实（约2倍柱体积溶剂），在保持10cm以上的溶剂高度下，慢慢加入石英砂，再把液面压到与石英砂平齐，柱子就装好了。 注意悬浊液既不能太稠也不能太稀，太稠会影响流动性，气泡不容易赶出，导致柱身有空洞，太稀了太花时间，影响工作效率。 三、装柱。有干法装柱和湿法装柱两种 干法和湿法装柱的共同注意事项及优缺点比较： 鉴于硅胶是弱酸性的，如果过柱样品对酸敏感或者本身是碱性的，一般在装柱溶剂中添加2-5%的三乙胺，可以改善敏感和拖尾。 如果是加压，一定记住先泄压，再关柱子的阀门，否则柱填料可能会被顶空，如果是真空负压，则一定是先关阀门，然后再泄真空，否则也是会被顶空。总而言之，时时刻刻都要保持柱子的下端压力一定不能超过上端。 干法优缺点： 这种方法的好处是速度快，柱子装的非常紧密，柱效相对较高。 不好的地方是，操作较苛刻，柱子的下阀门一定不能漏。 有时候柱子过于密实，影响洗脱流速。 湿法优缺点：操作相对简便，但费时费事费溶剂，硅胶容易扬尘。 四、上样。有干法上样和湿法上样两种 干法上样： 就是把样品溶解后加入粗硅胶，然后除去溶剂，先把样品制砂。要点有以下几点，样品一定要全溶，不能用细硅胶，制砂一定要干燥彻底。特别是溶样溶剂如果是大极性时，更要干燥彻底。否则，会影响洗脱时的实际洗脱比例，导致分离效率过低。样品：粗硅胶：溶剂的大概比例为1:1~2：2左右，具体比例还要根据样品的溶解性和粘稠性确定。难溶、粘稠的样品，硅胶和溶剂的比例就越高。硅胶过少会让粘稠难溶的样品粘结成团，无法均匀分散，洗脱的时候，洗脱剂只会冲洗到团块的表面，而洗不到团块的内部。导致拖尾严重和回收率损失。硅胶过多则造成浪费，同时也会造成拖尾。 四、上样。有干法上样和湿法上样两种 湿法上样：对于在较弱极性溶剂（如石油醚）中易溶且流动性良好不粘稠的样品，可以用湿法