免疫学实验指导..docxVIP

　实验一免疫球蛋白的粗提（盐析法）实验目的学习免疫球蛋白的粗提方法实践IgG分离纯化过程了解分离纯化抗体的原理实验原理随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多，有单一法，常用盐析法、凝胶柱层析、离子交换剂层析以及免疫亲和层析等技术对血清抗体进行分离纯化。但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过透析或层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进行分离。水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础，在蛋白质胶体溶液中加入一定量的（NH4）2SO4或Na2SO4盐类，使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白质溶解度也随之降低。蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级析出。33% （NH4）2SO4为沉淀IgG的最适饱和度。二、实验材料与试剂配制1．人全血清（购买商品）2．硫酸铵饱和溶液硫酸铵 800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。3．0.01Mol/L pH7.4 PBS液 A液：0.10Mol/L NaH2PO4液 NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至 1 000ml B液：0.10Mol/L Na2HPO4液 Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。4．0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液三、实验步骤1、取免疫血清 0.25 mL置于1.5ml离心管中，加 0.25mL 生理盐水/PBS2、逐滴加入饱和（NH4）2SO4 0.5 mL（此时为50%饱和度），4℃，静置 20 min，3000 r/min 离心 20 min3、弃上清，取沉淀溶于1 mL 生理盐水/PBS中4、逐滴加入饱和（NH4）2SO4 0.5 mL（此时为33%饱和度），4℃，静置 20 min，3000 r/min 离心 20 min重复步骤3～4，2次取沉淀溶于0.5 mL 生理盐水中，-20摄氏度保存备用四、注意事项1、盐析时注意饱和硫酸铵加入血清中的速度和方式，边加边缓慢摇动，并避免产生气泡。2、注意区别前后2次盐析所采用的饱和硫酸铵的终浓度。五、实验报告1、记录实验步骤结果2、思考题：分离纯化IgG时，为什么硫酸铵的饱和度先调至50%，然后调至33%？加入硫酸铵溶液时，为什么要一滴滴地加？实验二琼脂糖免疫电泳实验一、实验目的1、了解免疫电泳的原理和用途。2、掌握免疫电泳的操作过程和方法。3、掌握免疫电泳实验结果的分析方法，并对粗提的蛋白进行检测。二、实验原理免疫电泳为区带电泳与双向免疫扩散的结合。先利用区带电泳技术将不同电荷和分子量的蛋白抗原在琼脂内分离，然后在与电泳方向平行的方向上开槽，加入抗血清。37℃下使两者扩散，各区带蛋白在相应的位置与抗体反应形成弧形沉淀线。免疫电泳原理见图。实验材料和试剂配制人全血清、粗提蛋白、兔抗人血清、琼脂糖、0.05mol/L巴比妥缓冲液（PH8.6）、电泳槽、电泳仪、载玻片、毛细管、塑料吸管实验步骤1、配制1.5％的琼脂糖，加热使之融化，（巴比妥缓冲液配制）2、吸取4－5 mL琼脂糖溶液，均匀涂布到载玻片上，注意要马上用吸管尖把琼脂表面整平，若有气泡立刻除去，并立即于中间横放一根毛细管，待凝，制成2mm的琼脂板。3、打孔及开槽，挑去孔内的琼脂，槽内琼脂暂不挑出。（打一个孔即可）。于酒精灯上小心烘烤，使琼脂与玻璃板贴紧。4、用微量加样器加入10－20uL的粗提蛋白和人全血清，不要溢出（可加入指示剂）。5、把载玻片放到电泳槽中，倒入巴比妥缓冲液，琼脂板两端用滤纸与缓冲液搭桥，接通电源，电压10-12v/cm电泳1-2h。6、样品中有蓝色染料，当蓝色接近另一端时，终止电泳，小心取出载玻片。7、用刀片在胶体的中央，划两道平行线。刀刻要深及底部，两道平行线间隔不可大于3 mm。用大头针挑去琼脂。8、加入兔抗人血清，放入湿盒中