第8章-2-兽药残留分析.ppt

三、四环素类兽药残留样品前处理 （一）样品提取 由于四环素类抗生素的强极性性质，在生物样品中易与蛋白质形成共轭物而提取困难。稀无机酸可将四环素类化合物与蛋白质分离，但四环素类化合物一旦进入水相，由于其在有机相的分配系数较低，再将其提取入易挥发的有机相进行浓缩和净化就变得困难了。 请在此输入您的标题 多数四环素类化合物对光敏感，而且在强酸或碱性条件下不稳定，在弱酸性（ pH=3 ）条件下形成差向异构体，在强酸性（ pH 2 ）条件下形成脱水产物。 请在此输入您的标题 分析液体样品（如牛奶）中的四环素类抗生素残留时，一般需要一个预离心步骤以除去脂肪。 在净化步骤之前，还需采用乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液对样品进行稀释。对于半固体样品，如肌肉、肾脏、肝脏，通常需要更强烈的样品预处理步骤以破碎组织。可采用切碎机和组织均质器通过机械分散作用来完成这一步骤。 请在此输入您的标题 将四环素类抗生素从可食动物产品中分离出来是一个相当复杂的步骤。 主要困难在于这些化合物在被分离时倾向于与金属离子形成鳌合物或与样品基质成分键合。 为提高提取效率，推荐采用EDTA 、柠檬酸盐、琥珀酸盐或草酸等四环素类化合物的竞争性鳌合剂。同时需要考虑采取适当的提取条件以减少与蛋白质的键合。 请在此输入您的标题 强酸或酸性脱蛋白剂非常适合用来降低四环素类化合物与蛋白质的键合作用，但在强酸性条件下四环素类抗生素易降解为脱水产物。 pH4 .0 的琥珀酸盐缓冲液、酸性乙睛和酸性甲醇都被成功应用于四环素类抗生素的提取。 请在此输入您的标题 （二）样品净化 在样品提取步骤获得的水相或有机相样品提取液中待测四环素类抗生素的浓度可能非常低，而且还可能含有共提取物。如果样品的最终溶液中含有共提取物，会增加检测器的背景噪声，难以检测痕量浓度水平的待测物质。为减少干扰和浓缩待测化合物，初始样品提取液需要采用进一步的净化步骤，如液一液分配、固相萃取、超滤、免疫亲和色谱或在线微量富集技术。 请在此输入您的标题 1.固相萃取 SPE 由于不需要大容量的溶剂，样品基质中的四环素类抗生素。又省时省力，固相萃取被广泛用于分离和净化生物样品中的四环素类抗生素。 TCs 具有苯环、多种活性官能团，因此各种如的 SPE 都能用于 TCs 的净化， SPE 主要包括 C18 柱、阳离子交换柱、苯基 SPE 柱等。 应用于分部环素类抗生素的固相萃取剂主要为反相 C18 吸附剂。由于四环素类抗生素易于和金属离子鳌合，为避免待测物在过固相萃取柱时的潜在损失，一般先采用 EDTA 对反相固相萃取柱进行预处理。 请在此输入您的标题 2.液-液分配 可通过将待测化合物从水相转移到不互溶的有机相而直接去除基质成分。 存在问题：四环素类化合物由于极性太强，在任何 pH 值都不能被定量转移入不互溶的有机相。 当采用四丁基铵盐作为离子对试剂时，在 pH8.2 条件下采用二氯甲烷提取土霉素和四环素的回收率超过 85 ％。 请在此输入您的标题 （三）四环素类兽药的分析 四环素类抗生素残留的测定方法主要包括微生物抑制法、 酶联免疫法、分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱一质谱法等。样品经过提取和净化后，四环素类抗生素可通过薄层色谱或液相色谱进行分离，再采用分光光度、荧光或质谱检测系统进行定量浦定。 请在此输入您的标题 1.微生物抑制法 微生物法是一种传统的测定四环素类化合物和其他抗生素的分析方法。 测定原理：是根据抗生素对其敏感的特定微生物的生长抑制作用 ,通过抑菌圈的大小来进行样品中抗微生物药物残留的判断(测定抑菌圈直径，样品抑菌圈直径小于阳性对照抑菌圈直径判定为阴性，否则判定为阳性)。 请在此输入您的标题 蜡状芽抱杆菌 ATCC 11778 是一种经典的用于分析四环素类的微生物，其对金霉素的灵敏度为 0.005mg / L ，对四环素和土霉素的灵敏度为 0.025mg / L ，对二甲胺四环素的灵敏度为 0.001~0.002mg / L 。 相对于其他分析方法，微生物抑制法操作简便、价格低廉、不需要精密仪器和复杂的样品前处理过程，因而适合大量样品的筛选。 微生物抑制法的最大缺点是不能区分具体的四环素种类，因此也难以进行定量检测。 请在此输入您的标题 2.酶联免疫法 间接酶联免疫法可用来检测牛奶中的四环素类抗生素。 四环素-牛血清白蛋白共轭物用于抗体制备，同源的四环素- β -酪蛋白共轭物作为包埋试剂，而羊抗兔 IgG-辣根过氧化物酶作为第二抗体。 牛奶样品经离心脱脂，采用磷酸盐缓冲液至少以 1 :30 的比例进行稀释后，直接采用酶联免疫法进行测定，检测限可达 5 ug / kg 。 请在此输入您的标题 当采用商业化试剂盒检测蜂蜜中的四环素、金霉素和土霉素残留时发现其对金霉素具有强烈的交