细胞培养技术(实验篇)四.ppt

5、利用此1小时制备Hep-2细胞悬液并加入上述混合液中。 Hep-2一瓶，PBS洗涤二次 VTP 1ml消化 约5min后倾去 37℃至细胞从玻璃瓶脱落 加营养液6ml，细胞计数，成1×106/ml，每孔加100μl细胞悬液。37℃ CO2孵育，次日（24h）观察结果。 实验步骤（3） 实验报告 鸡胚原代成纤维细胞的制备 VSV的增殖 Hep-2细胞的传代 VSV TCID50滴定 干扰素（IFN）效价测定/中和试验 2013.1.25前交619房间细胞培养技术（实验篇） 安徽医科大学微生物学教研室 2013年1月3日 合肥 实验四 一、VSV TCID50滴定 二、干扰素效价测定（一） 三、中和试验（一） 一、VSV TCID50滴定 实验目的 掌握病毒TCID50滴定的基本原理和计算方法 熟悉病毒TCID50的应用 实验原理 多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解、细胞肿大或脱落等，这种改变称为病毒的致细胞病变效应（CPE)。 TCID50 （50%tissue culture infectious dose) 是病毒毒力的传统表示法， 即能在50%组织细胞培养孔或试管内引起细胞病变所需的病毒最高稀释度。 TCID50滴定法是50%（50% endpoint)终点法测定病毒滴度的方法之一，是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至培养成的单层细胞，将每个稀释度造成的细胞病变做成曲线，找出造成50%细胞病变的终点稀释度。 实验材料 细胞：Hep-2细胞株 病毒：水泡性口炎病毒（VSV) 试剂：DMEM培养液(或RPMI1640)，小牛血清，PBS， VTP 材料：细胞板，微量移液器，tip头 实验步骤 细胞的制备与培养(已完成） 病毒的稀释与接种 结果观察与计算: 结果的记录时间为感染细胞的病变不再进展为止，不同的病毒不一样，本实验所用的水泡性口炎病毒（VSV)增殖较快，一般48小时左右即可观察染色。 计算方法常用的有Reed-Muench法。 制备细胞(已经完成）：按传代细胞培养的方法制备Hep-2细胞悬液，细胞浓度约为1× 106/ml。用微量移液器将细胞悬液加入40孔板微孔中，每孔100μl，37℃，5%CO2培养箱中培养24h，形成良好的单层。 病毒稀释：用含3%小牛血清的DMEM(或RPMI1640）维持液将待测病毒VSV作连续10倍稀释，依次为10-1、 10-2 、 10-3 、 10-4 、 10-5 、 10-6 、 10-7。 1 2 3 4 5 6 7 1.8ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml 1.8ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.2ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 稀释病毒液 待测VSV DMEM维持液 管号 稀释度 病毒接种：将长好单层细胞的培养板各孔培养液全部倾弃，用微量加样器将各稀释度VSV病毒液加入相应孔中，每孔100μl，每个稀释度加2孔。同时设细胞对照孔，不加病毒液，只加维持液。37℃，5%CO2培养箱中培养。 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 1 2 3 4 5 6 7 8 9 C DMEM维持液 复孔 试验孔 结果观察：于培养后的不同时间，18h、24h、48h在倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病变不再发展时记录结果，细胞病变程度表示法如下： -：表示无细胞病变 +：表示1%～25%的细胞有病变 ++：表示26%～50%的细胞有病变 +++：表示51%～75%的细胞有病变 ++++：表示76%～100%的细胞有病变 Reed-Muench法计算TCID50，举例如下： 病毒稀释度 病变数/ 接种数 累积数（孔） 累计病变细胞孔 有病变 无病变 比例 百分比（%） 10-3 8/8 18 0 18/18 100 10-4 6/8 10 2 10/12 83 10-5 4/8 4 6 4/10 40 10-6 0/8 0 1