绿色荧光蛋白分子实验.ppt

注意事项： 提取过程应尽量保持低温。 沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。 实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。 在细菌的细胞内，质粒主要以超螺旋形式（ccDNA）存在。在提取质粒的过程中，还有另外两种存在形式：线性（linear DNA）和松弛型(ocDNA)。 超螺旋DNA 线形DNA松弛螺旋状DNA 7、质粒酶切鉴定及电泳检测 限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA双链，形成一定长度的DNA片段。 如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： EcoRⅠ：G↓AATTC HindⅢ：A↓AGCTT 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。 酶切反应系统包括：DNA，酶，buffer，灭菌水 注意：不同公司的酶和buffer系统是不同的，所以一个反应应该用同一个公司的酶和buffer。 1，DNA：重组质粒，样品中不应该有酚，氯仿，酒精，EDTA，盐离子等的污染，以免影响酶的活性。 2，酶：酶量并不是越大越好，酶体积不应该超过总反应体积的1/10。(因为酶是储存在50%甘油中的，而反应体积中甘油的浓度超过5%就会使酶出现星号活性，即切割不应该切的位置)。 3，buffer：不同的酶配有不同的buffer，产品目录和酶的使用说明中会说明该酶用哪种buffer， 有些buffer中需要另外添加BSA。 4，反应体积，通常1到几微克DNA的反应体积可以控制在50到100微升，用20单位的酶来切。 5，反应条件，大多数酶都是37度半小时以上。 6，双酶切 因为不同的酶需要不同的buffer，所以有两种情况： 1) 两种酶是同样的buffer。尽量用同一个公司的酶，这样就跟单酶切操作差不多，可以同时加入两种酶，注意事项是体积和酶量。 2) 两种酶是不同的buffer，先用一种buffer离子浓度底的酶切，电泳检测，单酶切开以后，将产物抽提，沉淀，加入离子浓度高的buffer再酶切。 操作注意事项：1. 吸样量一定要准确;2. 为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶;3. 要求在冰上操作，并充分混匀;4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染;5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。 实验结果 * 绿色荧光蛋白报告基因的克隆 基本原理：多聚酶链式反应是DNA的体外酶促扩增。是利用两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，使目的DNA片段在一定时间以指数方式增加百万倍。 1. PCR扩增获得目的基因 1、dNTP的质量与浓度——dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。 2、模板（靶基因）核酸——模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。 3、Mg2+浓度——Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 4、退火温度对PCR的特异性有较大影响。 5、变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 6、循环数——过多易产生非特异扩增。 影响因素： 7、酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 8、引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一