蛋白质分离纯化技术总论.ppt

蛋白质分离纯化 2009-3-28 蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定pH的溶液中都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量范围可达1万至100万之间，其分子的直径在1~100 nm，为胶粒范围之内。 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷（双电层） 水化膜 蛋白质分离纯化的一般原则 总目标：增加蛋白制品的纯度或比活 1.前处理(pretreatment)：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离(rough fractionation)：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离(fine frationation)：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶：分离纯化的最后步骤 蛋白质的分离纯化方法 根据蛋白质分子大小的差异分离—透析和超滤 根据蛋白质的溶解度差异分离—沉淀、盐析等 根据蛋白质的电荷差异分离—电泳、离子交换等 根据蛋白质与某些物质的吸附差异—吸附分离 利用生物分子专一性结合的特性—亲和层析 透析（dialysis） 原理：利用蛋白质分子不能通过半透而将其与小分子物质分开 常用的半透膜为玻璃纸或纤维素材料 超过滤（ultrafiltration） 盐析(salt precipitation) 原理：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 等电点沉淀和pH控制 不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。这样沉淀出的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 有机溶剂分级分离 丙酮、甲醇、乙醇等沉淀: 能使蛋白质在水溶液中的溶解度将低。低温（零下40-60度）进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。 温度对蛋白质溶解度的影响 在一定温度范围内，约0~40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，如人的血红蛋白从0~25℃，溶解度随温度上升而将低。在40~50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。 大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。 层析的主要设备 常见色谱柱 自动分步收集器 ?单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。 ?分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快； ?小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。 优 点 ?1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结构稳定，所以凝胶本身不与样品发生化学反应。 2.凝胶层析的操作条件较温和，不易引起生物物质的变性，即使用来分离一些理化性质不稳定的物质也很少被破坏。 3.样品得率高，重复性好。如果按比例扩大柱的体积和高度，可进行大量样品的分离纯化。 缺 点 1.要求样品和洗脱液的粘度很低。 2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限，所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。 3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用，如芳香族化合物与脂蛋白等。 凝胶的结构与性能 凝胶也称分子筛，是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。 常用分子筛：1、葡聚糖凝胶（Sephadex） 型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质 小蛋白质 除盐 2、琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA） 孔径大，用于分离大分子物质 3、聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP） 葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex） 结构：葡聚糖用交联剂1-氯-2,3-环丙烷使葡聚糖之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联聚合而成的 三维空间网状结构。 Sephadex的三维空间网状结构的网孔大小取决于交联度，交联度的大小可在合成Sephadex时控制加入交联剂的百分比决定。交联剂的百分比高，交联度大，网状结构愈紧密，孔隙愈小，吸水后膨胀也愈小，机械强度高，分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百分比低，分离物质的