免疫组织化学染色技术(研究生)全解.ppt

The samples were immunostained with anti-F4/80 (a, green) and anti-nAChRa7 (b, red). Nuclei were counterstained with Hoechst33258 (c, blue). Signals in a–c were digitally merged in d. The nAChRa7+/F4/80+ cells presented as yellow signals in the merged image. 免疫荧光染色的基本程序近似于酶免疫组织化学染色，但应注意以下问题： 1. 免疫荧光不需要用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2. 二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 3. 免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油（0.01M PBS 1:1）。建议购买抗淬灭的封片液，使切片可以保存更久。 4. 荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 5. 免疫荧光染色假阳性可能多，需分别设定阳性和阴性对照。 6. 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 第五节???细胞凋亡的检测技术 一、凋亡细胞的形态学改变 细胞表面：伪足、微绒毛等消失 细胞体形态：细胞皱缩、变形，体积变小 细胞核：染色质浓缩、早期染色质聚集于核膜边，呈新月形 或环形，晚期碎裂 细胞器：密集但形态及结构完整，早期内质网短暂扩张 细胞膜：完好，晚期包裹细胞器或核碎片，形成凋亡小体 在组织中表现：常常以单个细胞散在发生 周围组织反应：凋亡细胞或小体被邻近巨噬细胞、上皮细胞 吞噬、降解，不发生炎症反应 发生条件：属于基因控制的程序性细胞死亡，多发生于器官 萎缩、细胞介导的免疫杀伤机制、小剂量毒素作 用以及多种病理生理状态 二、细胞凋亡的形态学检测方法 （一）凋亡细胞的光镜和荧光显微镜检测 1．制片 （1）常规组织学切片，进行脱蜡和水化。 （2）培养细胞可用细胞离心仪制片。由于凋亡细胞在制片中容易破碎，所以应采用低速离心制片（250g，离心5min），并事先将载玻片用1%BSA处理，使细胞易于贴附。离心后涂片，稍经空气中干燥后，迅速用1%多聚甲醛4℃下固定15-30min，然后转入80%乙醇后固定1-2h，保存于-20℃待用。 2．染色方法 可用多种方法进行染色。 （1）可采用常规的组织学染色方法，如Giemsa染色、HE 染色或Mayer苏木素染色。 （2）采用荧光染料染色 ? Hoechst 33258 。 ? DAPI（4’, 6 -diamidino- 2-phenylindole; 4,6- 二脒基-2-苯基吲哚 ）。 DAPI是含有特定AT序列DNA的一种嵌入剂，能像 Hoechst dye一样粘附在DNA双螺旋的小沟区。尽管DAPI不能通过活细胞膜，但却能穿透扰乱的细胞膜而对核染色。 ? PI（propidium iodide, 碘化丙啶） 。 3．结果观察 典型的凋亡细胞形态学改变：细胞体积缩小及变形；核浓染及丧失亚形态结构。在组织切片上可见巨噬细胞或邻近的上皮细胞吞噬凋亡细胞或凋亡小体。 Blue: nuclear DNA; Green: mitochondria; Red: lysosomes 上图：control 下图：condensed unclei in apoptotic cells Hoechst staining as a method for detecting cell nuclei （二）凋亡细胞的电镜观察 采用电镜的常规方法固定、包埋和制片。可用透射电镜或扫描电镜进行观察。 透射电镜下，凋亡细胞核染色质浓缩、核膜消失，可见核染色质呈新月形，或核碎裂成大小不等的核碎片；内质网扩张，而细胞器如线粒体等形态仍保持良好，可见被膜结构包绕的细胞器，即凋亡小体。扫描电镜下，细胞表面结构如伪足、微绒毛等消失，细胞膜呈现波浪状起伏或出现突起小泡。 （三）凋亡细胞的原位末端脱氧核苷转移酶标记法（in situ term