02 基因工程的酶学基础.ppt

* 工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。 * 酶加入量不超过总体积十分之一 * 需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时反应。 需两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别不大，中，高盐，可同时反应。利于酶较贵重的盐浓度缓冲液。 两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低，高盐，不可同时反应。 a) 低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。 b) 沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液 c）两种酶不能同时反应，有先有后。 * 连接反应的效率：主要是取决于反应混合物中 DNA末端的浓度。 插入片段与载体的分子比值为1:1或2:1较合适 * S1核酸酶用来切平突出的单链末端及证实intron的存在 * 先将待测双链DNA 片段中一条单链的一端选择性地进行末端标记, 然后加入恰当浓度的DNase Ⅰ, 使在DNA 链上随机形成缺口, 经变性后电泳分离, 放射自显影, 即可形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA 条带. 但当DNA 片段与相应的序列特异性DNA 结合蛋白结合后, DNA 结合蛋白可保护相应的DNA 序列不受DNase Ⅰ的攻击, 因而在放射自显影图谱上, DNA 梯度条带在相应于DNA 结合蛋白的结合区域中断, 从而形成一空白区域, 恰似蛋白质在DNA 上留下的足迹,因而被形象地称作足迹法. 如果同时进行DNA 化学测序, 即可判断出结合区的精确顺序 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 CCG GGCTATCGG E.coli DNApolI Mg 2+，4dNTP CCGATAGCC GGCTATCGG 1. 5’→3’聚合酶活性 GATAGCC AGCTATCGG TCGATAGCC AGCTATCGG E.coli DNApolI Mg 2+ + pC，pT 5′ TCGATAGCC AGCTAT E.coli DNApolI Mg 2+ TCGATA AGCTAT + pC，pG，pC 5′ 2. 5’→3’外切酶活性 3. 3’→5’外切酶活性 DNA聚合酶的三种活性 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 一、大肠杆菌DNA聚合酶I 用途： 1） 除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时） 2） 补齐5’-突起端 3） 合成第二条cDNA 4） 切口移位制备探针 其中用途2) 和3)常用大片段 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 二、Klenow片段 　（一）基本性质 　　　大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即Klenow片段。 　　　Klenow片段仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→ 3`的核酸外切酶活性。 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 二、Klenow片段 　（二）用途 　 1. 3’端补平：补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。 　 　2. DNA 3’末端标记:在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。 5’ klenow klenow 5’ 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 二、Klenow片段 　（二）用途 3. cDNA第二链的合成 mRNA cDNA第一链 逆转录 cDNA第二链 klenow 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 引物 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 三、T4噬菌体DNA聚合酶 （一）T4 DNA酶的基本特性 　　　有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性（降解单链更快） 。 　　　在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切 　 　　　在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 三、T4噬菌体DNA聚合酶 （二）用途 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 四、T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶 　（一） T7噬菌体DNA聚合酶 　　　从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成，已知DNA聚合酶中持续结合能力最强的一个。 　（二） T7噬菌体DNA测序酶 　　　通过对T7DNA聚合酶进行化学修饰，去除3’?5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。 第三节