030细胞工程-第三章 细胞培养的基本方法.ppt

最严峻的挑战-污染 (contamination) 细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念。遇到培养污染要分析原因，及时处理。 培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回，加入抗生素也基本无能为力。特别是霉菌和细菌。 1.细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原体和病毒等。 在出现以下情况时培养的细胞可能有污染： a.培养液的酸碱度发生异常的改变。 b. 培养液出现混浊。 c. 光镜观察到菌丝和颗粒。 d. 细胞出现死亡或增殖缓慢等 2.常见污染及判断 2.细菌污染：常见革兰氏阴性菌（白色葡萄球菌） 、大肠杆菌、假单胞菌。 现象：初期变化不明显，后期培养液浑浊，镜下可见菌体。 预防：青霉素和链霉素可预防。 3.真菌污染 ：常见烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。 特点：大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面；镜下呈丝状、管状或树枝状，纵横交错，散在细胞周边和细胞之间。 抗真菌制剂可预防和排除真菌污染。 4.支原体污染：介于细菌和病毒之间，能独立生活的最小微生物。 最常见、不易察觉；大小介于0.2-2 μm，约1%可通过滤菌器 对酸耐受性差，对热较敏感，青霉素无效 。 “正常”感觉 。 支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰DNA的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。 支原体检测方法和处理 1）荧光技术检测：支原体含有DNA，能与一种荧光染料Hoechest 33258特异性的结合，可根据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支原体。 2）直接培养法：实验室常用。 3）放射自显影检测： 4）DNA分子杂交及PCR法 5）电镜检测法 6）3H-胸腺嘧啶掺入法 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。 萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。 支原体污染细胞的Hoechst33258染色结果 支原体污染电镜照片（×30K） 5.病毒的污染及检测： 借助宿主细胞进行复制装配成新的病毒颗粒或整合到宿主DNA上进行复制。 1）致细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）或集落的检测：采用相差显微镜检测 2）血细胞吸附试验； 3）鸡胚接种。 4）电子显微镜检查法 病毒致细胞病变效应 6.细胞间交叉污染 为避免细胞间交叉污染，应注意： ◆ 了解各细胞系的特征； ◆ 培养各细胞系的操作手续要快速； ◆ 培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等； ◆ 吸过培养液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培养液和酶的瓶内； ◆ 经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改变，通过染色体或同工酶谱分析，检查是否有交叉污染 消毒(Sterilization) 无菌操作(Aseptic technique) 7.污染的预防 a.抗生素处理：预防性应用比污染后使用好。采用5--10倍于常用量的冲击法，高浓度抗生素作用24--48小时。 b.加温除菌：支原体热耐受性差，可把污染的细胞41度处理5～10 小时，以杀灭支原体，但对培养细胞本身也有很大影响。 c.共培养法：从动物腹腔采集巨噬细胞，与污染细胞共培养。 d.重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，4～5周后，重复克隆2次。 e.动物体内接种除菌法：受支原体污染的肿瘤细胞可接种到动物皮下或腹腔中，借助动物的免疫系统杀灭支原体。 8.污染的排除 Chinese hamster ovary cell 中国仓鼠卵巢细胞 经标准化生产的培养板、培养瓶（或皿）一般成像效果都较好，但反复刷洗过的玻璃或塑料器皿将严重影响分辨力。 ，这样可以去除漂浮的组织块和死细胞，提高成像清晰度 观察细胞时要有无菌概念，动作要轻，避免猛烈振荡。观察时间不要太长，观察次数也不要太频繁，以免影响细胞生长。 视频：细胞计数 指测定细胞群中1000个细胞中分裂细胞所占的比率。（细胞工程） 意义 体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力,可用分裂指数来表示.它与生长曲线有一定的联系,如随着分裂指数的不断提高,细胞也就进入了指数生长期.分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比,它是测定细胞周期的一个重要指标,也是不同实验研究选择细胞的重要依据. 测定方法 分裂指数测定可用盖片培养法，亦可直接在小平皿中进行。在计算分裂相时要掌握好分裂相标准，选择密度近似区观察计数。 一、原理 体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力,可用分裂指数来表示.它与生长曲线有一定的联系,如随着分裂指数的不断提高,细胞也就进入