06 DNA重组的操作.ppt

(二) DNA序列测定法 六、转译筛选法（补充） 　　　借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。 　　　适用于mRNA转录丰度高的外源基因。 　 　(一)无细胞翻译系统 　　　能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。 mRNA 无细胞翻译系统 35S标记的 甲硫氨酸 翻译 35S标记的肽链 PAGE电泳 放射自显影 比较放射性 带纹的位置 载体+外源DNA 转录 与预期的产物分子量相符？ 　(二)杂交抑制转译法 　　mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。 单链mRNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 能翻译 mRNA DNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 不能翻译 1. 原理 2. 过程 (二)杂交抑制转译法 　(三)杂交释放转译法 　1. 原理 　　　在高甲酰胺溶液中，载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。 2. 过程 载体和插 入的cDNA 总mRNA cDNA基因的 mRNA 杂交 洗脱 cDNA基因的 mRNA 体外翻译 cDNA编码的蛋白 电泳 凝胶放射自显影 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 收集 35S标记的氨基酸 (三)杂交释放转译法 　(四)DNA-蛋白质相互作用筛选法 　　专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 小　结 一般克隆与筛选策略 本章重点掌握内容 掌握转化、转导、转染的概念与区别 掌握外源基因与载体的连接方式 了解基因转移的方法与区别 掌握转化子、重组子、选择和筛选的含义 ?-半乳糖苷酶显色反应选择法的原理 核酸杂交法的原理与方法 OVer!!!! 四、免疫化学检测法 　　 利用免疫学的原理，检测克隆基因的表达产物。 蛋白——蛋白“杂交” 　　　利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 (一)放射性抗体检测法 　1. 抗体与产物的结合方式 　　 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为以下几种作用方式： 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二 抗结合蛋白 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 125I标记的二抗 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 固相支持滤膜 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二抗 结合蛋白 125I标记的二抗 (一)放射性抗体检测法 　1. 抗体与产物的结合方式 　(一)放射性抗体检测法 　 2. 放射性抗体检测法过程 　(一)放射性抗体检测法 　3. Broome-Gilbert双位点检测法 　检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。　 质粒基因A 插入基因B 表达 质粒蛋白A 外源蛋白B 融合蛋白 固相支 持滤膜 抗A抗体 125I标记的 抗B抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 质粒蛋白A 外源蛋白B 固相支 持滤膜 抗A抗体 发光，底片曝光 (一)放射性抗体检测法 　3. Broome-Gilbert双位点检测法 　(二)免疫沉淀检测法 　　　检测分泌型产物。 　　1. 原理：抗原——抗体凝集反应。 　　2. 方法 　　　把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。 对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。 　(三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　　　Enzyme-linked immunosorbant assay 　1. 原理： 　　一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 　　二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 　　酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 酶 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 无色的底物 有色的产物 比色观察 酶 　(三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　2. ELISA检测的一般步骤 　　（