10-核酸分子杂交2016.ppt

核酸探针的类型 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 常用的探针标记物： 放射性同位素： 3H、32P、35S、125I等。 优点：高特异性，高灵敏度 缺点：存在放射性污染，半衰期短 非放射性同位素： 荧光、地高辛、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。 核酸分子杂交信号的检测 放射性同位素标记探针 放射自显影 非放射性同位素标记探针 偶联反应+显色反应 检测杂交信号 放射自显影检测杂交信号 放射自显影是指利用放射线在x线片的成影作用来检测杂交信号。 取出杂交膜，在Whatman滤纸上晾干，用保鲜膜包好，在暗室中置于X线片上，加增感屏，固定于暗盒内，-70℃曝光适当时间（1-7天），在暗室中取出X线片，显影、定影，即可在X线片上读出杂交带。 非放射性标记探针：偶联反应+显色反应 Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联 Dig-DNA探针 + 抗Dig抗体-碱性磷酸酶（AP） 或辣根过氧化物酶（HRP） + 底物 ：BCIP+NBT 蓝紫色 或 DAB 红棕色； TMB 蓝色 核酸分子杂交技术（nucleic acid molecular hybridization）是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。 探针( probe )：带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。 第三节 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交 ↓ 固相杂交 液相杂交 膜上印迹杂交 核酸原位杂交 核酸分子杂交的分类 一、膜上印迹杂交 印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定 的固相支持物上的方法。 常用的固相支持物： 硝酸纤维膜（NC）、尼龙膜、PVDF膜（聚二氟乙烯膜）等 特点： 较强的结合核酸的能力（10μg/cm2） 指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。 操作步骤： 预杂交 杂交 洗膜：洗去膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针分子的过程。 1．印迹方法 Mechanics of transfer 虹吸印迹法（Capillary） 真空转移法（Vacuum） 电转移法（Electrophoretic） Blot DNA to membrane Capillary Blotting (upward) no special equipment required! 1975年 E. Southern Southern DNA 印迹转移技术 DNA片段1kb，1小时 DNA片段15kb，18小时 Electrophoretic blotting 不宜用硝酸纤维素膜 一般2~3小时， 最多6 ~8小时 especially good for small fragments resolved by PAGE 2. 预杂交prehybridization 概念：为了减少探针与膜的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。 常用的封闭物： （1）变性的非特异性DNA:如鲑鱼精DNA、小牛胸腺DNA，又称为覆盖DNA。 （2）高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400 、脱脂奶粉 基本实验步骤： electrophoresis Transfer Block blocksubstrate probe Migration hybridization Vacuum blotting 30~60分钟 more efficient and quantitative than capillary must apply vacuum evenly and not too strongly 3．印迹类型 Southern印迹杂交（ 检测靶分子为DNA, 检测是否含有目的基因） Northern印迹杂交 斑点及狭缝印迹杂交 反向斑点杂交 菌落或噬菌斑杂交 提取DNA 限制性