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第三章 愈伤组织的诱导与培养 第一节 愈伤组织的诱导与继代培养 愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。 大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。 愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。 一、愈伤组织的诱导及其形态特征 1、愈伤组织的诱导 1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth） 外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。持续十几小时~几天。 2）分裂期（divition stage/phase）： 外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。 3）形成期（formation stage/Differentiation phase）： 外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。 2. 愈伤组织的形态特征 质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。 颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。 一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。 3. 影响愈伤诱导的关键因素 愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。 生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。 二、愈伤组织的继代培养 继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。 愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。 方法：一般每3~4周继代1次；每次取生长迅速、浅色、疏松的愈伤进行；继代用培养基与原来相同，或根据培养目标、培养阶段不同而改变成分，通常是改变激素配比。 注： 通过调节培养基成分，特别是生长调节剂种类和比例，可使不同类型愈伤在一定程度上相互转变。 继代培养的目的：获得大量优良愈伤，供进一步研究之用。 优良愈伤的特点： 1）疏松易碎和旺盛的增殖能力，以便建立悬浮系或无性系； 2）经长期继代仍保持较强的再分化能力，便于获得再生植株或进行遗传操作。 三、悬浮培养 悬浮培养（suspension culture）：将疏松易碎、生长旺盛的愈伤小块放入液体培养基中进行振荡培养，以形成分散性好的游离单细胞和小细胞团的培养技术。 小型培养用100~250ml三角瓶；大规模培养用特制的培养容器进行。 1. 悬浮培养的用途 1）提供一个相对一致的细胞群体，供生理生化、胚胎发生、基因表达等研究。 2）次生代谢物质生产。 3）细胞突变体的诱变与筛选。 4）分离原生质体。 理想的悬浮系：应由大量增殖迅速的游离细胞组成，但一般的悬浮系是由单个细胞与大大小小的细胞团块组成的混合物。 2. 影响悬浮培养的因素 1）培养基成分：一般，适于培养松脆愈伤的培养基也适于建立悬浮系。 生长调节剂：通常生长素较多分散性好，如甘薯茎尖，MS+2mg/L 2,4-D。 无机磷：适当增加。 葡萄糖：作碳源效果较好。 2）细胞密度：接种足够的细胞块，过滤去掉大块。 3）振荡速度：30~150rpm，使愈伤破碎、均匀分布，促进气体交换。 4）继代时间：一般7~15 d一次。 3. 悬浮培养物的继代与测定 1）继代培养： 小型培养：将培养瓶静置，吸去上清，加入新鲜培养液；或者吸取悬浮液，转接到含新鲜培养液的培养瓶。 大规模培养：在培养容器中不断注入新鲜培养液，排出旧培养液，保持体积恒定和营养物的补充。 2）细胞增殖的测定： A. 细胞鲜、干重：尼龙丝网收集细胞，经真空抽滤称鲜重，经60~80℃烘干称干重。 B. 细胞密实/叠积体积：将已知体积的悬浮液转入刻度离心管中，低速离心，用每毫升培养液中细胞的毫升数表示。 C. 细胞数：血球计数板或特制的计数盘。 注意： 1）长期继代培养会发生体细胞无性系变异（somaclonal variation）：染色体数目、结构变异，或基因突变，不利于保持供体植物的遗传稳定性，并使再生力下降甚至丧失，但有利于育种和遗传研究，是重要育种方法，如从马铃薯育成抗早疫病品种，从水稻育成抗白叶枯病品种等。 2）长期继代培养会造成试管苗玻璃化加重。 因此，要及时进行分化培养。 第二节 愈伤组织分化和植物再生 一、器官发生与植株再生 器官发生（o