第十二章核酶预案.ppt

第十二章 核酶 第一节 ribozyme 第二节 脱氧核酶 第一节 ribozyme 一、ribozyme的发现 二、ribozyme的概念 三、ribozyme的种类 四、ribozyme研究进展与展望 20世纪80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的T.Cech 在研究四膜虫 rRNA前体的剪接时发现，其 26S RNA 具有自我催化活性，由此提出了核酶的概念。 美国耶鲁大学的S.Altman在大肠杆菌中发现了RNase P具有生物催化功能，从而改变了生物催比剂的传统概念。为此，T.Cech和S.Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。 二、ribozyme概念 概念：具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂。 又称核酸类酶、酶RNA、 核酶类酶RNA。 特点：核酶的作用底物可以是不同的分子, 或者作用 底物是同一RNA分子中的某些部位。 与蛋白质酶相比：核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。打破了酶是蛋白质的传统观念。 核酶的功能：? 1.?核苷酸转移作用。? 2.?水解反应，即磷酸二酯酶作用。? 3.?磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用。? 4.?脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。? 5.?RNA内切反应，即RNA限制性内切酶作用。 三、Ribozyme的种类 根据作用方式分为： 剪切型（把RNA前体的多余部分切除）， 剪接型（把RNA前体的内含子部分切除并把不连续的外显子部分连接起来） 根据所作用的底物不同分为： 自体催化（催化分子内反应） 异体催化（催化分子间反应） 根据核酶的结构和催化反应： RNA和蛋白质复合物：核糖核酸酶P。 小分子的RNA：能够进行分子内自我切割反应，且不需蛋白质参与。这些RNA分子可以分为两个部分，一部分是底物，另一部分是酶。将具有酶活性的序列克隆后可制成人工核酶去作用于独立的底物。 Ⅰ、Ⅱ型内含子：将自身从前体mRNA中剪接出去的作用 共同点：都涉及磷酸二酯键的切割或连接。它们作用的底物 是RNA，可以是RNA分子本身，也可以是别的RNA分子。? 几种能进行自我剪切的RNA结构 四、Ribozyme研究进展与展望 对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。 可找出其结构功能域和必需基团，据此可进行分子 改造，以获得分子更小的、高效的ribozyme 。 研究热点：从催化分子内反应的自我剪切ribozyme设 计出催化分子间反应的ribozyme。 1、抗病毒方面的研究 HIV是一种逆转录病毒，是核酶应用研究的理想靶标。HIV主要攻击T淋巴细胞，破坏机体的免疫系统，使抗病能力降低，导致死亡。 Wong等(1998) 利用发卡型核酶抑制HIV-1 基因表达，在一期临床试验中，用带有发夹状核酶的载体体外转染患者的T细胞, 然后再将这些T 细胞重新输入到患者体内，结果显示患者体内 HIV-1 的滴度降低。 在的二期临床试验中，Mit suyasu等(2009) 用逆转录病毒载体将抗HIV核酶导入到造血干细胞中，然后将造血干细胞注入到感染 HIV 的患者体内，结果38名患者携带了该种疗法所使用的完整拷贝。研究结果发现, CCR5是HIV-1 R5 毒株的重要细胞复合受体之一，该受体在 HIV-1感染初期起重要的作用，但是它的缺失对宿主是无关的，因此CCR5 可作为核酶切割的理想靶点。 HBV是一种逆转录病毒。其生活史如下： HBV进入肝细胞 在宿主酶作用下以负链DNA为模板合成正链DNA 形成共价闭合环状DNA 在宿主RNA聚合酶?作用下合成mRNA(亦称前基因组RNA, pgRNA) 在HBV逆转录酶作用下合成负链DNA 在HBV DNA 聚合酶作用下合成正链DNA 形成子代闭合环状DNA。 由于 HBV 的复制必须经过RNA 的过程，所以可设计特异性核酶用于切割 RNA，从而阻断HBV 的复制过程。 Fritz 等(1992) 合成了针对HBV pgRNA 的3个不同的核酶，直接作用于体外转录获得的 HBV 的pgRNA，结果显示这3个核酶都能准确地切割底物RNA，表明HBV RNA易被核酶切割。 栾中华等(2005)将HDV 核酶基因序列构建到原核载体中, 并转染细胞, 通过 ELISA检测和定量PCR 测定载体的抑制效果，筛选出了两种抑制效率高的 HBV 核酶, 抑制率达 68%。 王传玺等(2007)将 HBV核酶基因转入重组逆转录病毒载体pMSCV/ U6 中，运用脂质体转染细胞，嘌呤霉素筛选稳定细胞株等方法，构建了重组逆转录病毒载体，在包装细胞系中