第十四章：大肠杆菌基因工程预案.ppt

酶促裂解法：多残基位点 为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段编码寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接头片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和作用序列，其断裂位点在Arg的C末端。纯化后的融合蛋白用Xa处理，即可获得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广泛用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物。 寡聚型异源蛋白的表达 从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷贝数（即基因剂量）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。随着重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正常生长代谢却因能量不济受到影响，因此通过增加质粒拷贝数提高外源基因表达产物的产量往往不能获得满意的效果。 另一种通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是构建寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略 以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点 目的蛋白高效表达:在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以在一定程度上改善表达量。 稳定表达小分子短肽：短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高。 目的产物回收困难：寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但裂解后的短肽分子容易出现序列不均一性。 寡聚型目的蛋白表达系统的构建 基本战略： 包涵体变性复性操作： 在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质，包涵体的蛋白质属于这两种状态，需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作。 N：天然状态 U：变性状态 C：共价修饰 A：集聚状态 I ：有效变性复性过程中的中间状态 X：脱离有效变性复性过程而进入集聚的中间状态 温度 表达水平 细菌遗传性状 异源蛋白氨基酸序列 形成包涵体的影响因素 分泌型异源蛋白的表达 大肠杆菌中异源蛋白的定位 以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中。 通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基。蛋白产物N端的信号肽序列是蛋白质分泌的前体条件。 以分泌形式表达蛋白的优点： 目的蛋白稳定性高。如重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中，其稳定性大约是细胞质中的10倍。 蛋白易于分离 外源重组蛋白N端的甲硫氨酸残基可在信号肽的专一性剪切过程中被有效除去。 分泌表达形式的缺点： 相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。 蛋白质的分泌机制： 原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在周质和培养基中的蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，对蛋白酶不敏感。 分子伴侣的作用机制： 识别新生肽段折叠过程中暴露的错误结构，并与之结合生成复合物，从而阻止不正确的非折叠途径，促进折叠向正确方向进行。在正确折叠产物中，分子伴侣与之分离，不参与正确折叠产物的功能活动。 分泌型目的蛋白表达系统的构建 包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。 因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。 融合型异源蛋白的表达 除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白 以融合形式表达目的蛋白的优缺点 目的蛋白稳定性高：尤其对分子量较小的多肽效果更佳。 目的蛋白易于分离：利用受体蛋白成熟的