溶菌酶检验标准..docVIP

术语和定义 ：在25℃、pH值为6.2的条件下，于450nm处每分钟引起溶酶小球菌体（Micrococcus Lysodeiktidus）溶液吸光度下降0.001所需要的酶量为一个酶活单位U。： 技术要求 外观和性状要求 粉酶为白色或微黄色的结晶或无定形粉末。技术指标 粉酶水分含量：≤12%。 粉酶粒度：420μm孔径分析筛筛上物≤4%。 粉酶炽灼残渣：≤10.0%。 酶活指标 表1 产品成分分析保证值 项目 指标 粉状型 ≥U/g（u） 500000 卫生指标 符合GB 13078和NY/T 722的有关规定。 本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T 6682中规定的三级水，所用试液中的标准溶液，在没有注明其他要求时均要求按GB/T 601，GB/T 602制备。 外观的测定 取样品少许放入烧杯，下衬白纸进行目测。 粉酶水分的测定 按GB/T 6435 规定进行检测。 粉酶粒度的测定 按GB/T 5917 规定进行检测。 粉酶炽灼残渣的测定 按《中国兽药典》规定进行检测。 卫生指标的测定 按饲料卫生标准GB13078和NY/T 722规定的方法进行。 的测定 溶酶小球菌（Micrococcus Lysodeiktidus） 将溶酶小球菌接种于固体培养基上，置37℃培养48小时，用无菌水将菌体洗下，用纱布滤过，滤液离心后，倾去上层清液，用水洗涤菌体数次，然后用少量水悬浮，冰冻干燥，得淡黄色粉末，供测定用，保存一年。时在营养琼脂斜面上活化，传代培养，工作用菌种不超过5代，斜面菌种从培养好到使用时间最长不超过2个月。并将培养好的斜面菌种，放置4℃冰箱保存。制备的菌悬液可以使用一周，不用时放置4℃冰箱保存。磷酸缓冲液称取磷酸二氢钠（NaH2PO4.2H2O）11.7g, 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）7.86g，加900mL水溶解,调pH值至6.2，定容至1000mL。硫酸铜溶液%三氯醋酸仪器 分析天平0.1mg； 牛津杯：牛津杯内径6.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm，高10.0±0.1mm，每套牛津杯的重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光滑平坦。管壁厚薄一致； 陶瓦盖：内径约103mm，外径108mm,平坦，吸水性强。应定期清洗、干燥或干热灭菌； 游标卡尺：精度0.02mm； 双碟：内径约90mm，外径16mm～17mm的硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡； 超净工作台：有效工作面局部洁净度100级。用于试验菌的接种传代或菌悬液制备； pH酸度计：精确到0.01 分光光度计：0nm下测定吸光 离心机：00r/min以上； 秒表：每小时误差不超过5s 恒温培养箱鉴别 固体样品：取本品10mg，溶于1mL水中，加30%三氯醋酸2滴，产生白色沉淀。 取试管一支，加5%溶菌酶水溶液2滴、10%氢氧化钠5滴及1%硫酸铜溶液1滴，混匀后，应显紫玫瑰色。 特定浓度的溶酶小球菌悬浮液在450nm条件下存在一定吸光度，溶酶菌作用于溶酶小球菌底物会引起吸光度降低，通过计算指定时间内吸光度降低的幅度可以计算出溶菌酶的活力。mol/L磷酸缓冲液稀释到酶活单位为100U/ mL ~200U/mL，备用。 将保存好的溶酶小球菌在营养琼脂斜面上活化，传代两次后的菌体37℃培养48小时，再用生理盐水从培养基上洗脱下来并稀释到一定倍数，在25℃时，在450nm波长处测定吸光度A0为0.65～0.75。精密取底物悬浮液2.5mL，放入比色杯中，在450nm波长处测定吸光度，作为零时读数，然后取样品溶液0.5mL，加入比色杯中，用秒表，迅速混合，磷酸缓冲液到0秒时记下吸光度A6。 试样酶活力的计算 1000 XD = × (A0-A60) × N × 2 ———————— （1） M 式（1）中： XD — 待测样品的溶菌酶活力，U/g A0 — 0秒时的吸光度 A60 — 60秒时的吸光度 M 样品质量，g N — 样品总的稀释倍数 保存好的溶酶小球菌在营养琼脂斜面上活化，传代两次后的菌体37℃培养48小时，再用生理盐水溶酶小球菌供测定用mol/L磷酸缓冲液稀释到酶活单位在5000U/mL左右，备用。 标准品、样品的滴加： 取8个双碟，，在每个双碟中对称放入4个牛津杯，分别成对角滴加标准品高(SH)、标准品低（SL）及样品高(TH)、样品低(TL)两种浓度的溶液，直至牛津杯口平满。注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩散时间对测定结果有影响。（注意：标准品必须现配现用，不能隔夜。从测定平板的制备到进入培养箱培养，整个过程必须在2