第八章非线性色谱预案.ppt

第八章 非线性色谱原理及其在蛋白分离纯化中的应用 韶关学院生命科学院 第一节 概述 生物制品的分离纯化对产品质量具有重要的意义。传统方法由于效率低，费时，劳动强度的等原因，已经不使应现代生物技术发展的要求。 色谱技术自1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名以来，不断改进，在生物产品的制备中使用日臻。1950s出现气相色谱，1960s制成了自动化的色谱仪，使色谱方法在制备和分析领域得到更广泛的应用。 一、色谱法的基本特点 1、分离效率高 理论踏板的高度仅相当1-2个固定相的高度。HPLC的色谱柱短到3-20cm，就能分离多达几十种分子。 2、应用面广 从无机物到有机物，小分子到大分子，热敏感到热不敏感的分子均适用。特别适宜用于生物样品的纯化与复性。 3、操作参数多 按固定相、流动相及洗脱液组成性质不同，色谱有许多种的分类和亚类，适用于各种分子分离。 4、高灵敏度在线检测 HPLC均带检测装置。 5、快速分离 带有加压系统，是分离速度加快，时间缩短。 6、连续自动化 计算机技术的植入，使HPLC实现连续进样、洗脱、收集，且高度自动化。 二、线性色谱与非线性色谱 线性与非线性是数学函数的概念，描述自变量和应变量之间的关系。 在色谱学上，如果流动相与固定相中的样品浓度Cm与Cs之间呈线性关系，此时的色谱分配过程就是线性色谱。 即 Cs =KCm K为分配系数 如果流动相中样品浓度Cm与固定相中的浓度Cs之间不呈线性关系，而呈现出其他的函数关系，此时的色谱分配过程就是非线性色谱。 在分析色谱中，由于上样量少，体积小，样品浓度低，一般符合Cs =KCm ；而制备色谱上样量和体积均比分析色谱大几个数量级，样品浓度大，不符合线性色谱。这种区分不是绝对的，如果制备色谱的浓度降低，也可能符合线性色谱的特点，Cs =KCm 。 分析与制备是色谱的目的，而线性与非线性是色谱的物质分配特性，务必不能混同。 三、非线性色谱与线性色谱的区别 1、样品保留值（时间）可变。在线性色谱样品保留值是不变的特征常数，可用于定性；而非线性色谱中随浓度变化而改变。 2、峰形不对称。线性色谱中峰形是对称的高斯分布，而非线性色谱中则不对称，要么伸舌壮要么拖尾壮。 3、峰高与浓度不呈线性关系。线性色谱中峰高与浓度呈线性关系。 第二节 非线性色谱（non-linear chromatography）的理论基础 非线性色谱理论是研究样品在固定相与流动相中的浓度处于非线性关系状态下，各种实验参数对色谱分离过程的影响，建立起柱参数、溶质性质及操作条件之间的定量关系式。 一、吸附过程及吸附等温线 吸附是常发生在2相界面上的现象。原因是处于界面上的分子/原子与其内部的分子/原子具有不同的能量和性质，产生一种不平衡的倾向，这种差异就造成了吸附现象。 1、吸附分类 ⑴化学吸附 吸附热大，不可逆 ⑵物理吸附 吸附热小，可逆 非线性色谱理想的吸附是物理吸附，要避免化学吸附。 2、吸附等温线：一定温度下2相界面上的吸附过程达到平衡时物质分子在2相中的浓度间关系。 HPLC常见的等温线：凸形、凹形、S形、H形和阶梯形等5种，需用不同的数学模型描述 。 ⑴凸形 见于液-固系统中的多数小分子化合物。反映溶质在固相表面吸附达饱和时生成单分子层。浓度继续增加，等温线曲率渐减，最后为0。达到饱和。 ⑵ H形 是凸形等温线的特例，反映一类容易被吸附且容易达到饱和的物质的吸附状态。 ⑶凹形 适用于低浓度下，已吸附的分子又能吸附液相中的分子，形成多分析吸附层的物质。 所以等温线随浓度增加而增加。 ⑷S形 为凸形和凹形等温线的叠加产物，表明被吸附分子间有很强的作用力，能进一步吸附其他分子，而溶质分子与固相作用弱，或与表面覆盖无关。又分正S形和反S形等温线。随着溶质浓度增加，被固相表面吸附的分子稳定后又吸附其他分子，形成反S形等温线；溶质与固相表面吸附力弱，但被吸附分子与未吸附分子作用强，则易形成正S形等温线。 ⑸阶梯形 表明被吸附分子在固相表面随液相中溶质浓度增加会发生吸附取向改变或吸附状态的改变。每一阶梯代表一种吸附状态。 下面是等温线与色谱峰图 凹形 凸形 Cm 线形 Cs Sig tR 峰形 tR m 图8. 分布等温线类型及对色谱峰形和保留时间的影响 3、吸附等温线的意义 ⑴预测代表该吸附等温线的组分在非线性色谱的色谱峰图。凸形——拖尾，凹形——伸舌。 ⑵为物质的非线性色谱分离选择最佳条件。 ⑶反映被分离分子与固相表面的作用，有利于研究分子构形和吸附状态。 ⑷建立分子结构-吸附之间的定量关系，便于以分子结构预测吸附性能。由于分子的总吸附能是分子中各原子/基团吸附能的总和，测定出一定条件下各原子/基团吸附能，就可从组成结构推测其吸附行为。 4、