第二章分子荧光光谱法(去磷光)预案.ppt

上图：用鼠抗golgin 97和兔抗COX IV分别作为一抗，用CF 488染料标记的山羊抗鼠IgG二抗和CF555标记的山羊抗兔的二抗染色的HeLa细胞。用CF647-鬼笔环肽标记微丝，并用Hoechest33342标记DNA。（其中绿色=高尔基体、红色=线粒体，蓝色=细胞核，紫红色=细胞骨架） 基于菁类荧光染料一种双模式粘度探针，在非粘性或者低粘度的溶液中，由于中位醛基的自由转动，消耗了激发能，染料的荧光淬灭；随着溶液的粘度增加或者温度的降低，荧光发射增强，并且长波长的荧光对粘度的敏感性高，表现比例增加，荧光比例值最高达到12倍，同时染料在长波长处的荧光寿命从不到200 ps增加到1450 ps。能更好地对细胞内复杂环境的粘度进行成像检测，这是以前的检测中是无法做到的。 * 对于稀溶液，当? bc0.02时： IF----荧光强度 ?F-----荧光量子产率 b--吸收光程 ?--摩尔吸光系数 C--荧光物质浓度 当I0一定时， 2.5 分子荧光光谱法的应用 * 低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系， 高浓度时，由于自熄灭和自吸收等原因，荧光强度与物质的浓度不呈线性关系 2.5 分子荧光光谱法的应用 与紫外－可见分光光度法相比，其灵敏度可高出2－4个数量级，其检测下限通常可达0.1～0.001 ?gcm-3。 原因？ * 2.5 分子荧光光谱法的应用 （2）单组分的荧光测定 直接测定法：适用于有荧光的物质 间接测定法：适用于不发生荧光，或荧光量子效率很低物质。 利用化学反应使非荧光物质转变为荧光物质； 例：甾族化合物，经浓H2SO4处理后，使不产生荧光的环状醇类结构改变为能产生荧光的酚类结构。 荧光猝灭法，若被测物质具有荧光猝灭剂的作用，可测量荧光强度的降低来测定该荧光物质的浓度。 例：硼砂对姜黄素的荧光强度有显著的淬灭作用，可用于测定食品中的硼砂。 * 2.5 分子荧光光谱法的应用 无机化合物 金属离子与有机试剂形成荧光配合物后；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 * 2.5 分子荧光光谱法的应用 几种常用的荧光试剂 试剂 测定的元素 安息香 B, Zn, Ge, Si 2,2’-二羟基偶氮苯 Al, F, Mg 2-羟基-3-萘甲酸 Al, Be 8-羟基喹啉 Al, Be 有机化合物 脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃——荧光分析法是最主要的测定方法。 为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定 可测定结构复杂的大量有机物质，如：各种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等。 例： 3，4 – 苯并芘为强致癌物质 煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧垃圾都会产生3，4 – 苯并芘，汽车尾气也是主要来源 食品加工过程也会产生3，4 – 苯并芘，尤其是烟熏、油炸、烘烤食品 分析测定：用环己烷将3，4 – 苯并芘从试样中提取出来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化，然后用色谱法分离纯化，用95%C2H5OH稀释，用荧光分光光度计测定相对荧光强度进行定量 ——又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和海藻中， VB2易溶于强酸或强碱性溶液。 在低浓度情况下，I= KC，I与C呈线性关系，在pH6~7荧光最强 在430~440nm蓝光照射下，发出绿色荧光， ? em = 535 nm下测 I ，用标准曲线法测定 维生素B2 待测物 试剂 λ exmax λemmax 测定范围 ppm 丙三醇 苯胺 紫外 蓝色 0.1~2 糠　醛 蒽酮 465 505 1.5~15 氨基酸 氧化酶 315 425 0.01~50 维生素A 无水乙醇 345 490 0~20 蛋白质 曙红丫 紫外 540 0.06~6 肾上腺素 乙二胺 420 525 0.001~0.02 青霉素 α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮杂蒽 420 500 0.0625~0.625 玻璃酸梅 3-乙酰氧基吲哚 395 470 0.001~0.033 胍基丁胺 邻苯二醛 365 470 0.05~5 四氧嘧啶 苯二胺 365 485 10-4 * 2.5 分子荧光光谱法的应用 （2）单组分的荧光测定