第二章基因工程的工具酶预案.ppt

* 5.核糖核酸酶 H（RNase H） 降解DNA-RNA杂交分子中的RNA链，不降解单链核酸、dsDNA或dsRNA。 用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成 许多酶附带有该酶的活性，如AMV反转录酶。 * 6. 脱氧核糖核酸酶I (DNase I) DNase Ⅰ来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链 DNA 。酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口。 * 在Mg2+存在下，独立作用于每条DNA链，且切割位点随机。在Mn2+存在下，它可在两条链的大致同一位置切割 dsDNA，产生平端或1-2个核苷酸突出的DNA片段。 用途：制备RNA样品时除去DNA分子、切口移位，制备DNA探针 * 五、核酸末端修饰酶 1. 碱性磷酸酶 除去ss-DNA，ds-DNA 和RNA分子的5’-磷酸基团。避免不期望的链接。 细菌碱性磷酸酶（BAP） 牛小肠碱性磷酸酶（CIP）：CIP对热敏感 * 2. T4 多聚核苷酸磷酸激酶 催化ATP中的γ位的磷酸基转移到ss-DNA、ds-DNA和RNA分子的5’-OH上。 * 转移反应（I）：将 ATP的γ -磷酸基团转移到无磷酸的DNA 5 端，用于对缺乏 5-磷酸的 DNA 进行磷酸化 交换反应（II）：在过量 ATP 存在的情况下，该激酶可将磷酸化的 5 端磷酸转移给 ADP，然后DNA从ATP中γ-磷酸而重新磷酸化。 两个反应中使用的 ATP 均为放射性同位素标记[32p]ATP，那么反应的产物都变成末端获得放射性标记的 DNA 。 * * 用途 5’-端末端标记 分子克隆过程中获得5’-磷酸基末端，便于连接酶反应 * 七、其它酶 琼脂糖酶（Agarase） 琼脂糖酶是一种琼脂糖水解酶，用于从低溶点琼脂糖凝胶中分离纯化大片段DNA或RNA片段。该酶对热很稳定，反应时不需要缓冲液。 * 甲基化酶（Methylase） （1）Dam甲基化酶 （2）Dcm甲基化酶 （3）EcoKⅠ甲基化酶 （4）SssⅠ甲基化酶 第二章 基因工程的工具酶 * * 5.影响连接的因素 连接反应的温度：14~16 ℃ 酶的浓度：1~2U ATP的浓度：10μmol~1mmol 连接反应的时间：14~16h 插入片段与载体的比例：2~3：1 * 不匹配粘性末端的连接 * 三、DNA聚合酶（DNA Polymerase） E.coli DNA聚合酶 I Klenow 片段 T4 DNA 聚合酶 T7 DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶 反转录酶…… * 1. 大肠杆菌DNA聚合酶I (E.coli DNA Pol I) E.coli 的DNA聚合酶系统 Pol I 参与DNA修复 Pol II 参与DNA修复 Pol III 参与DNA复制 * 1.1 E.coli DNA Pol I的3种酶活性 5’→3’ DNA聚合酶活性，要求3’-OH的引物和模板DNA 5’→3’ 核酸外切酶活性，具有双链特异性 3’→5’ 核酸外切酶活性，DNA聚合酶I还能从游离的3’-OH末端降解dsDNA或ssDNA成为单核苷酸。 * 1.2 用途 除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时） 补齐5’-突起端 合成第二条cDNA 切口移位制备探针 * DNA杂交探针的制备 应用缺口转移法制备DNA杂交探针。 DNA样品加入适量的DNaseI、Pol I、32P-dNTPs和未标记的dNTPs。其中，DNaseI的作用在于给DNA分子造成断裂或缺口，随后Pol I则作用于这些单链缺口进行缺口转移，使反应混合物中的32p标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，并最终形成从头到尾都被标记的DNA分子。 * 切 口 转 移 * ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口 * 2. 大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段） 用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大肠杆菌DNA聚合酶I而得到的该酶的大片段，称为Klenow片段 没有5’→3’ 外切酶活性，而保留了5’→3’ DNA聚合酶活性和3’→5’ 外切酶活性 * 用途 用同位素标记具5’端突起的DNA片段末端 补平5’粘性末端 第二条cDNA链的合成 DNA序列测定 * * 3. T4 DNA聚合酶 从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶 5’→3’ DNA聚合酶活性 3’→5’ 核酸外切酶活性，可作用于ds-DNA和ss-DNA，其切除速度分别为40和4000 nt/min * * 4. T7 DNA聚合酶 5’→3’ DNA聚合酶活性和3’→5’ 核酸外切酶活性 T7 DNA聚合酶是所有已知的DNA聚合酶中最富延伸性，一般