第二章基因工程相关技术预案.ppt

基因 扩增技术---PCR （3）概念 首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 类似于DNA的体内复制。 （3）Taq DNA 聚合酶 PCR仪 2. PCR技术的原理 （1）DNA模板变性 （2）DNA模板与引物复性 （3）DNA链的延伸 （4）新一轮循环开始 3. PCR的过程 （3）第三步 延伸（extend） 温度循环 4. PCR的特点 （4）简便 5. 影响 PCR的因素 ② 最适温度高 ④ Taq DNA聚合酶的激活剂 （2）其它耐热的 DNA聚合酶 （3）引物（primer) ②引物的长度 ③引物的碱基序列 ④引物的碱基组成 3）避免形成引物二聚体（dimer） ⑤引物的Tm值 （4）模板（template) （5）dNTPs （6）Mg 2+ 的浓度 7. PCR技术的应用 （2）基因的体外诱变 核酸的分子杂交 核酸分子杂交的基本原理 DNA变性 方法 热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 DNA复性或杂交(hybridization) DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等 一、Southern blot 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 Southern blot 筛选结果 二、Northern blot 三、 原位杂交 核酸原位杂交的基本步骤 菌落原位杂交的基本步骤 但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。 ② 模板的量： 不能太多，100?l反应体系中20ng足够。 ① 纯度： PCR对模板DNA的纯度要求不高。 dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。 一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。 浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。 Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。 所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。 一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。 （1）扩增某一段DNA 从基因组中扩增； 从载体上扩增； 组织样本原位扩增； 微量残留DNA扩增； 分析模板序列； 在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。 技术关键： 利用引物的5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。 分子杂交: 具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链或部分双链的过程。 探针:带有易于检测标记物的、已知的核酸片段 DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。 分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 转移杂交或印迹杂交(blotting hybridization) 1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 主要步骤  用DNA（或RNA）探针检测RNA样品的方法。 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性 * * Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 （1） 1. PCR的发明 （2） Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。 1985年Cetus公司的科学家K.B. Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实。 1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。 当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。 Polymerase Chain Reaction Kary Mullis(于1985) 发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。 发展过程： 开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow