第一章蛋白质化学题库.ppt

蛋白质分子颗粒表面多为亲水基团，因而通过吸附水分子形成一层水化膜，这是蛋白质胶体稳定的重要因素之一，盐析就是利用（NH4)2SO4、NaCl等中性盐破坏蛋白质的水化膜，使之从溶液中析出，使不同性质的蛋白质初步得到分离。 加热首先使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。 3. 加重金属盐: 溶液pH大于蛋白质pI 时，蛋白质带负电荷，与重金属离子（Hg2+、Pb2+、CU2+等）结成不溶性沉淀。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子的浓度，也可以用于分离制备不变性的蛋白质。 4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法： 溶液pH小于蛋白质pI 时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂如单宁酸、苦味酸、钨酸；酸类如三氯乙酸、磺基水杨酸。 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。 肌红蛋白的8段α螺旋拐角处螺旋受到破坏，拐弯处是由l～8个氨基酸残基组成的无规卷曲，在C-末端也有一段5个氨基酸残基的松散肽链。肌红蛋白中四个脯氨酸残基各自处在一个拐弯处，一些难以形成α螺旋的氨基酸，如异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺等，也在此处出现。 （二）血红蛋白 去氧血红蛋白中各亚基间的盐键 血红蛋白的构象变化与结合氧（氧合作用） Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。 * 协同效应(cooperativity) 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity) 如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity) 变构效应(allosteric effect) 蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。 一、蛋白质分离、纯化、鉴定 的一般原则 选材主要原则是原料易得，蛋白含量高。 分离提纯某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级和细分级三步。 第一步是前处理（pretreatment）。分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丧失生物活性。为此，应根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。 破碎 如果目的蛋白在细胞内，需要进行细胞破碎，使蛋白释放出来。 如果目的蛋白质主要集中在某一细胞组分中，则可用差速离心方法将它们分开。 如果碰上所要的蛋白质与细胞膜或膜质细胞器相结合，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。 提取时一般用缓冲液保持pH。可溶蛋白常用稀盐提取，如0.1 mol/L NaCl。脂蛋白可用稀SDS或有机溶剂抽提，不溶蛋白用稀碱处理。抽提的原则是少量多次。 第二步是粗分级(rough fractionation) 。当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开。一般这一步采用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。 第三步是细分级，也就是样品进一步提纯。 一般用层析法，包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析及亲和层析等。必要时还可以选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后提纯步骤。 结晶是蛋白质分离提纯的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质的均一性，但只有某种蛋白质在溶液中数量占一定优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。蛋白质纯度越高，溶液越浓，就越容易结晶。结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较易得到结晶。 二、混合蛋白质分离、纯化方法 （一） 以分子大小为依据的方法 1、凝胶过滤 凝胶层析即凝胶过滤层析，也称分子排阻（molecular-exclusion）层析或凝胶渗透（gel permeation）层析。 凝胶层析优点包括：操作简便，所需设备简单。 分离效果较好，重复性高。 最突出的是样品回收率高，接近100％。分离条件缓和。 超滤过程是在常温下进行，条件温和无成分破坏，因而特别适宜对热敏感的物质，超滤过程仅采用压力作为膜分离的动力，因此分离装置简单、流程短、操作简便、易于控制和维护。 超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50％的浓度。  离心法是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一，也是生化实验室中常用的分离