分子生物学第10章基因文库和目的基因的分离题库.ppt

10 基因文库和目的基因的分离 建立基因文库的意义 基因文库的概念 图10－1 基因文库的构建 基因组文库的内容 基因组文库的大小 基因组文库的大小 实际克隆数的计算公式 实际克隆数的计算 DNA片段的制备 DNA片段的制备 DNA片段的制备 DNA片段的制备 DNA片段的制备结果图 cDNA文库的用途 cDNA文库的类型 cDNA文库的大小 cDNA文库的制备 mRNA的提取 mRNA的提取 图10－3 cDNA第一链的合成 图10－4 自身引导法合成cDNA第二链 图10－5 RNase H法合成cDNA第二链 图10－6 PCR法扩增 cDNA双链 cDNA与载体的连接 cDNA与载体的连接 cDNA与载体的连接 cDNA的正确表达 使用λ噬菌体载体制作文库 λ重组载体的包装方法 λ重组载体的包装方法 λ重组载体的包装方法 目的基因的克隆 表达融合蛋白和独立的外源蛋白 目的基因的克隆 酶联免疫检测 双位点检测法 目的基因的克隆 目的基因的克隆 图10－8 经酵母功能互补分离血红素生物合成的铁螯合酶基因(1) 图10－8 经酵母功能互补分离血红素生物合成的铁螯合酶基因(2) 定位克隆 酵母人工染色体 pYAC4的特点 YAC文库构建的基本步骤 YAC文库构建的基本步骤 YAC文库的构建和筛选 YAC文库的构建和筛选 三种终止密码子的别名 染色体步查的基本原理和步骤 染色体步查的基本原理和步骤 染色体步查的基本原理和步骤 染色体步查的基本原理和步骤 染色体步查的基本原理和步骤 染色体步查的基本原理和步骤 目的基因的克隆Ⅳ 5 定位克隆 — 染色体步查法 转座子标签法的基本原理 目的基因的克隆Ⅴ 5 定位克隆 — 转座子标签法 转座子标签法的基本原理 减法杂交和差示筛选 cDNA减法杂交 cDNA减法杂交（续） 减法杂交的缺点 基因组减法杂交 基因组减法杂交（续） 差示筛选 RDA原理图 另一种方法是用一种溶源菌提取物包装。SMR10菌株中的原噬菌体编码有包装所需的全部蛋白，但其cos位点缺失，诱导后产生的噬菌体DNA不能进入前头部。 包装后转导的效率为108 pfu /μg（ pfu， plaque forming unit，噬菌斑形成单位），要比用重组λDNA直接转染大肠杆菌高得多。 用目的基因的杂交探针原位杂交，从基因文库中分离目的基因 探针的制备： ①人工合成的寡核苷酸：已知蛋白质的氨基酸序列，反推出其基因的核苷酸序列，合成简并探针。尽量避免多密码子的氨基酸区段。 ②同源探针：利用目的基因在另一物种相应基因中的同源保守序列作探针。 在λZAP中，多克隆位点位于lac Z‘基因之前，合成出来的融合蛋白的氨基端为外源蛋白，羧基端为半乳糖苷酶的146个氨基酸。也有一些表达载体可以表达出独立完整的外源蛋白，如pKC30和pKK177-3，它们不产生融合蛋白，前者利用λ噬菌体的PL启动子，热激诱导表达；后者利用tac启动子，它是一个trp-lac杂合启动子，由lac阻遏物所调控，受IPTG诱导表达。 2 用抗体筛选表达文库 若使用表达载体构建cDNA文库，可以表达出各cDNA编码的蛋白质，这种cDNA文库叫表达文库。将表达文库的平板转印到硝酸纤维素膜上，裂解细胞后酶联免疫检测或125I标记抗体放射自显影检测。可以从表达文库中筛选出阳性克隆。此法要求宿主菌本身不合成该蛋白。 基因组文库不能是表达文库。 将菌落转印到NC膜上，用氯仿蒸气处理膜，使细菌在膜上裂解，或45℃高温诱导溶源菌裂解。然后加一抗结合，酶标二抗结合，加底物显色。 双位点检测法特别适合于检测融合蛋白：可把抗A-B融合蛋白A部分的抗体固定在固体基质上，最简单的方法是将抗A抗体直接涂抹在聚乙烯平皿上，然后将已裂解的转化菌转印到此平皿上，这时A-B蛋白通过A部分与平皿上的抗A抗体结合。再加放射性125I标记的抗B抗体，这些抗体结合到A-B蛋白的B部分。最后放射自显影，从原菌落复制平板上挑选阳性克隆。 3 用识别位点探针筛选表达文库 特定序列的双链DNA经标记后，可用于筛选能与该序列特异结合的DNA结合蛋白。如用启动子上的顺式元件筛选与之结合的转录因子。 4 蛋白质功能互补寻找目的基因 用突变体宿主菌，此宿主菌因某基因突变，带有容易检测出的缺陷表型，若用携带外源该正常基因的表达型载体转化，可使宿主菌的缺陷表型得到纠正，即为蛋白质功能互补。其理论基础是有些基因产物在不同的生物种中能发挥同样的功能。常用的宿主菌是营养缺陷型宿主菌。 如果不知道某个基因的核苷酸序列和其表达产物的氨基酸序列，也没有其表达产物的抗体，只知道它造成的表