b第七章动物基因工程上.ppt

注射完成后，用显微外科手术将25—40个受精卵移植到假孕雌鼠的子宫内，制造雌鼠假孕（可以让它与切除了输精管的不育雄鼠交配），将受精卵移入代孕母鼠子宫中大约3周后，接受过注射的受精卵发育生长为幼鼠，由代孕母鼠产下。 二、显微注射法（2） 假孕母鼠 二、显微注射法（2） 转基因动物进行检测： （1）取一小截幼鼠的尾巴，提取DNA进行Southern杂交或PCR检测，看是否存在转入基因。 （2）将它与另一只鼠进行交配来确定转入基因是否存在其生殖系中。 （3）通过对子代进行杂交产生纯合的转基因鼠。 二、显微注射法（3） 通常发育成转基因动物的受精卵一般占注射受精卵的5％。大多数情况下通过微注射法获得转基因动物的成功率只有l/1000。 对于显微注射用的DNA的要求高： 1）转入的外源基因要能够高效表达； 2）可以诱导表达； 3）具有帮助提高整合效率的序列。在注射的载体中加上MAR序列(matrix attach region)，这种序列位于染色体的基部，具有隔离作用，可以帮助基因高效表达； 4）在外源基因两端可加入微卫星序列，因在染色体上也有微卫星序列，两个微卫星序列可以帮助发生同源重组，提高整合效率。 二、显微注射法（4） 用显微注射法获得的几种转基因动物的成活率 转入基因的结构示意图 由于微注射法所注射的DNA在宿主基因组中是随机整合的，因此转入基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，从而干扰该基因的正常表达，影响转基因动物的正常发育和代谢；有的外源基因的表达具有时间性，得到的转基因动物可能只在一段时期内表达外源基因；有些个体可能因基因插入位点不合适而无法表达产物；还有些个体基因拷贝数过多导致表达过量，干扰自身的正常生理活动。 由于这些原因，DNA显微注射法的总效率还是比较低，但是这种方法仍然是目前获得转基因鼠的常规方法。 二、显微注射法（4） 多能胚胎干细胞：动物胚泡发育期的胚细胞重新导入另一胚泡期的胚之后，它仍然保持着分化成其他类型细胞的能力，这种细胞叫做多能胚胎干细胞。 胚胎干细胞(embryonic stem cell，简称ES细胞)的获得：分离胚泡的内层细胞团(inner cell mass)进行培养。ES细胞在无饲养层的平板中培养时会持续分化为肌细胞、神经细胞等多种功能细胞，只有在含有成纤维细胞的饲养层或白血病抑制因子(1eukemiainhibitoryfactor，LIF)的饲养层上生长时，才能保持其未分化状态，保持ES细胞的潜在分化能力。 三、胚胎干细胞法 从鼠的胚胎细胞培养胚胎干细胞 1. 在ES细胞的培养过程中，可通过基因工程操作，利用反转录病毒载体、电击法等多种方法将外源基因导人ES细胞，而不改变它的分化能力。 2. 将有功能的转入基因整合到ES细胞基因组内的某一非必需基因位点上，然后对这些细胞进行筛选培养，用于产生转基因动物。 3. 这种方法避免了在DNA微注射法与反转录病毒载体方法中存在的基因随机整合的问题。 三、胚胎干细胞法 通过胚胎干细胞获得转基因小鼠示意图 PCR法检测是否特异整合同源重组示意图 1. 正确整合的转基因胚胎干细胞系经培养后就可以移入胚泡期的胚胎了。将这些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，这样产生的子代其部分生殖系细胞就是由转基因的ES细胞形成的。然后在得到的转基因鼠间进行杂交，子代再配对杂交。 2. 根据孟德尔遗传定律，将有1／4的可能获得纯合的转基因鼠，即转入基因可以和正常基因一样分离。 三、胚胎干细胞法 ES法遗传学分析 1. 目前，利用ES细胞获得的转基因小鼠主要是用于基础研究。从原理上讲，胚胎干细胞法应当也适用于获得其他转基因动物，但遗憾的是，这种方法目前还没有在牛、羊、猪及鸡等家畜、家禽的研究中使用； 2. 利用ES细胞获得转基因动物的方法还有一个缺点，就是需要经过多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产仔数较少的大型哺乳动物来说，如牛、羊等，要获得转基因动物是一件需要大量资金投入的事情。 三、胚胎干细胞法 ES法评价 基因工程 第七章 动物基因工程 （上） 湖南科技大学生命科学学院 第七章 动物基因工程（上） 一、动物转基因技术的基本概念 二、动物转基因的载体 1. 病毒载体 2. 反转录载体 三、外源基因导入动物体内的研究方法 转基因动物 转基因动物（transgenic animal)：指动物基因组中整合有利用转基因技术所导入的外源基因（或特定的DNA片段）。 整个技术则称为动物转基因技术(transgenic technology或transgenesis)。 理论上讲任何动物都可以通过性系基因操作成相应的转基因动物（如：鱼、鼠、羊、牛等）。 转基因动物 1、1982年，R.D.Pa