过氧化物酶增殖体激活受体γ2转基因小鼠的制作及其影响因素分析.docVIP

过氧化物酶增殖体激活受体γ2转基因小鼠的制作及其影响因素分析 作者：赵四海，楚雍烈，郑华东，杨鹏辉，陈正兰，朱虹，范江霖，刘恩岐 【摘要】 目的 分析影响转基因小鼠制作的因素，优化转基因动物制作过程，建立适合本实验室的转基因小鼠制作方法。方法 利用显微注射方法制作转基因小鼠，对超数排卵的程序、受精卵的收集、外源基因的显微注射、胚胎移植和术后护理等影响因素都进行了对比研究。结果 优化了转基因小鼠的制作过程，减少了影响胚胎移植成功的不利因素，提高了过氧化物酶增殖体激活受体γ2(PPARγ2)转基因小鼠的制作效率(2.9%)。结论 成功制作了PPARγ2转基因小鼠，优化转基因小鼠的制作程序是提高转基因成功率的可行途径。 【关键词】 过氧化物酶增殖体激活受体γ2；转基因；小鼠；影响因素 转基因小鼠是生物医学研究中重要的动物模型; 　　采用显微注射方法，其制作流程如图1所示。 　　1.3.1 目的基因的构建 　　构建ap2+PPARγ2(cDNA)目的基因，克隆、扩增、纯化后备注射。 　　1.3.2 超数排卵和同期发情 　　PMS和hCG诱发供体雌鼠(donor)同期发情和超数排卵。在实验第1天腹腔注射PMS(0.5u/只)，46-48h后给供体鼠注射hCG(0.5u/只)，hCG注射当天(实验第3天)下午和雄鼠合笼，次日早晨6∶30-8∶00检查雌鼠有无阴栓来判定是否已经交配成功，交配成功的雌鼠阴道口可见白色的阴道栓。 　　1.3.3 受体鼠(recipient)的准备 　　实验开始前应该提前准备输精管结扎雄鼠，挑选至少两次和雌鼠交配后都不能使其受孕的结扎雄鼠备用。实验第3天下午挑选数只雌鼠和结扎雄鼠合笼，次日晨6∶30-8∶00检查雌鼠阴栓来判定是否已经交配，交配成功的雌鼠用来作为胚胎移植的受体鼠。 　　1.3.4 受精卵的收集 　　处死供体鼠，打开腹腔，取出输卵管(保留一小段子宫)。将输卵管置于M2培养液中，用小镊子撕开输卵管膨大部，可见有受精卵团溢出，用吸管将受精卵团转移至含有透明质酸酶的M2培养液滴中，吹吸数次，洗掉泡沫细胞[5]。将受精卵转移至含有M16培养液滴的培养皿中，CO2培养箱内短暂培养。将受精卵转移至含有M16培养液滴的注射用平皿中，覆盖矿物油，准备显微注射。 　　1.3.5 显微注射 　　首先在倒置显微镜低倍镜下找到受精卵，然后转换至200倍下进行显微注射。寻找可以清晰看见两个原核的适合注射的受精卵(图2A)，用持卵针吸住一个卵，将注射针刺入受精卵雄性原核(因雄性原核较大，易注射)，加压将PPARγ2基因溶液注射到受精卵雄性原核，可见原核膨大(图2B)。注射后受精卵CO2培养箱内短暂培养。 　　1.3.6 胚胎移植 　　沿受体鼠背部中线，最后一根肋骨水平切1cm左右切口，找到输卵管。将DNA注射完毕后将外观形态良好的受精卵吸入移卵管，解剖镜下将受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部，缝合切口。 　　1.3.7 转基因小鼠的鉴定 　　约19-21d后受体鼠产下子代仔鼠。取大于3周龄仔鼠尾尖0.5-1cm提取DNA，PCR初步鉴定基因导入情况[67]，筛选出转基因阳性小鼠。 　　1.5 统计学处理 　　采用 SPSS11.5 统计软件进行分析。根据资料类型分别采用t检验和χ2检验，以Plt;0.05为差别有统计学意义(双侧)。 　　2 结 果 　　2.1 激素注射时间和收集受精卵时间对受精卵细胞的影响 　　为了探索适合本实验室条件的受精卵采集方法，我们设计三个不同实验，进行比较研究。第1组：第1天13∶00 腹腔注射PMS，第3天12∶00给hCG，第4天11∶00收集受精卵。第2组：第1天11∶00腹腔注射PMS，第3天10∶30给hCG，第4天13∶00收集受精卵。第3组：第1天11∶00腹腔注射PMS，第3天10∶30给hCG，第4天14∶30收集受精卵。其中第1组从104只供体鼠收集到1374枚卵细胞，平均每只收集13枚；第2组从102只供体鼠收集到1750枚卵细胞，平均每只收集17枚；第3组从172只供体鼠收集到2756枚卵细胞，平均每只收集16枚。经统计学分析，第2组和第3组收集的受精卵数显著多于第1组(P均lt;0.01)。通过改变激素注射时间和取卵时间可以获得更多的受1 精卵用于显微注射。 　　2.2 注射DNA溶液的量对受精卵的影响 　　外源DNA溶液注射过多容易引起受精卵溶解，过少制作效率低[4]。我们统计了12次原核不同DNA溶液注射量对受精卵存活影响的数据，第1组：原核稍微膨大(约膨胀30%-60%，根据受精卵原核大小，显微注射时肉眼估计)。第2组：原核显著