鸡贫血病毒apoptin蛋白编码基因的克隆和序列分析.docVIP

鸡贫血病毒Apoptin蛋白编码基因的克隆和序列分析 作者：刘德纯 王健生 王作仁 段小艺 陈武科 杨广笑 【摘要】 　　目的：为了寻找肿瘤特异凋亡蛋白，克隆鸡法氏囊组织中鸡贫血病毒Apoptin蛋白的编码基因并进行序列分析. 方法：根据基因数据库资料设计合成引物,以成鸡法氏囊组织中提取的DNA作模板，通过PCR获得了特异扩增产物,将其插入到pGEMTeasy载体并转染感受态E.coliDH5α菌株,提取质粒经限制性内切酶酶切鉴定后，使用DNA测序仪测定插入片段的DNA序列. 使用DNAsis分析软件分析所克隆的DNA序列及其编码蛋白质，并与数据库中Apoptin蛋白的编码基因相比较. 结果：序列分析表明，成功地克隆了鸡贫血病毒的Apoptin基因，同基因数据库中的相关资料比较发现与山东报道的Apoptin基因（GenBank AY171617）的核酸序列一致，同鸡贫血病毒全基因序列中的Apoptin序列（GenBank AF 313470）有6个核酸差异. 结论：Apoptin编码基因的克隆为特异诱导肿瘤细胞凋亡治疗肿瘤奠定了基础. 【关键词】 鸡贫血病毒 凋亡素 克隆 测序 0引言 鸡贫血病毒(chicken anemia virus, CAV)是由DanenVan Oorschot等［1］在1979年发现并能引起雏鸡贫血死亡的一种环状病毒.CAV基因组长度约2.3 kb［2］,能分别编码VP1,VP2和VP3三种蛋白质. 其中VP3蛋白是功能蛋白质,由121个氨基酸组成，它包含两个富含脯氨酸的序列和两个带正电的区域，具有诱导被感染鸡血细胞凋亡的活性,是鸡贫血病毒的主要致病因子,根据此特性将该蛋白命名为凋亡素（Apoptin）［3］. 在Apoptin诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用机制研究方面已取得较大进展［4］, Apoptin能特异性诱导肿瘤细胞和转化细胞调亡，其发生作用不依赖p53基因，而且不被Bcl2过表达所抑制，因此这种Apoptin可能成为一种很有前途的能选择性地诱导肿瘤细胞和转化细胞发生凋亡的药物. 本研究旨在从自然生长的家鸡法氏囊中分离、提取CAV DNA，通过PCR方法扩增CAV的Apoptin编码基因，将其插入克隆载体PGEMT中,使用双脱氧终止法测定插入片段的DNA序列，同Genbank的数据库比较证实获得了CAV的Apoptin编码基因克隆，为研究Apoptin治疗肿瘤奠定了基础. 1材料和方法 1.1材料4只低体质量（lt;1400 g），低产卵的3月龄雌鸡（购于西安市郊区某鸡场）;PGEMT质粒、E.coliDH5α（西安市华广生物工程有限公司实验室提供）. 耐热的TaqDNA聚合酶、各种限制性内切酶、DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、蛋白酶K, DNA Mr标准，华美生物公司；E.coliDH5α受体菌，华广生物工程公司. 1.2方法 1.2.1病毒DNA提取将鸡颈静脉放血处死，立即分离法氏囊，置液态氮冷冻保存；取100 mg冷冻组织，在1 mL的匀浆缓冲液（50 mmol/L TrisHCl, 100 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, pH 8.0）中制备组织匀浆；取500 μL匀浆加入SDS和蛋白酶K，使其终浓度分别为1和200 mg/L，37℃温育120 min消化组织蛋白，消化后加入等体积的酚和氯仿/异戊醇各抽提一次，收集上清液加入RNase，37℃温育60 min，再次用酚和氯仿/异戊醇各抽提，加入二倍无水乙醇沉淀，收集沉淀使用700 mL/L乙醇洗涤后干燥，使用100 μL TE缓冲液溶解备用. 1.2.2引物的设计根据GenBank发表的CAV基因序列设计扩增引物. 正向引物5′CGG CCG GCG TGG GAT GAA CGA TCT CCA AGA AGA TAC3′, 　　反向引物5′CAA GCT TCA GTC TTA TAC GCC TTC TTG CGG TTC3′. 粗斜体表示在正向引物和反向引物的5′端加入的Nae I 和Hind III酶切位点，在正向引物和反向引物中分别加入了CG和C保护碱基. 为了作Apoptin同相关蛋白的融合表达在反向引物3′端删除了终止子. 1.2.3PCR反应将上述目的基因进行PCR扩增，反应参数为：94℃ 5 min预变性, 94℃ 60 s, 60℃ 60 s, 72℃ 90 s,循环30次后,72℃延长5 min；PCR产物的鉴定与回收及同线性载体pGEMT连接、受体菌的转化按常规分子生物学方法进行. 1.2.4阳性重组子的筛选与鉴定转化菌涂在含氨苄青霉素的加入