感受态细胞制备..docVIP

实验步骤： 1.从平板上挑取直径大约2-3mm的单菌落，转接到2-3管5ml的液体LB或者SOB培养基中。 2.在试管中过夜培养后，按不同的接种量分别接种于三瓶250ml SOB，18度200rpm培养（最好在晚上接种，以便于白天收菌。可以接种三个由低到高的浓度，确保至少有一瓶在第二天不会长过） 3.取样监测培养物OD，当OD达0.55时（其中一瓶达到足矣），将该瓶菌放置于冰水混合物冰浴10min。 4．在无菌操作台将冰浴过的菌液分装到灭菌50ml离心管中（不要装太满）然后再4度下，2500g离心10分钟（注意是2500g不是2500rpm）。 5．在无菌操作台中弃去上清液（尽可能去除干净），用20ml冰遇冷的转化缓冲液TB重新悬浮菌体，动作尽量轻柔（用枪小心吹吸混匀），操作时不应持握管底菌体的部位。 6．然后在4度下，2500g离心10分钟，无菌操作台中弃去上清。再加入预冷的20mlTB重悬菌体。 7．加入DMSO至终浓度7%，冰上放置10min。 8．迅速分装到已经在-80℃冰箱预冷过的EP管上，盖紧盖子，在液氮中冷冻。然后转移到-80摄氏度冰箱保存。 验证 取出其中一管，冰上融化后各1/3分别涂布于LA LK LB三个板上，37摄氏度培养，看看有无污染 可以另取一管，转化已验证质粒看看转化效率。 需要准备的材料以及溶液配方 灭菌50ml离心管若干 SOB培养基 TB（转化缓冲液） 灭菌的EP管（装一烧杯的量足够）新鲜灭菌的大枪尖一盒 灭菌的KCl溶液 2M MgCl2溶液 DMSO SOB Medium and TB (Transformation Buffer) SOB 2% (w/v) bacto tryptone TB 0.5% (w/v) yeast extract 10 mM Pipes 10 mM NaCl 55 mM MnCl2 2.5 mM KCl 15 mM CaCl2 10 mM MgCl2 250 mM KCl 10 mM MgSO4 在加入MnCl2之前先用5N KOH调pH值到6.7，adjust pH to 6.7 with 5N KOH prior to adding the MnCl2 pH 6.7 - 7.0 ＩＬ LB To 950 ml of deionized H2O , add: 在950ml蒸馏水中加入 Tryptone 10 g 蛋白胨 10g Yeast Extract 5 g 酵母粉5g NaCl 10 g 氯化钠 10g Shake until the solutes have dissolved. Adjust the pH to 7.0 with 5 N NaOH (~0.2 ml). Adjust the volume of the solution to 1 liter with deionized H2O . 溶解后用5N NaOH调节到pH7.0，定容到1L。 1L SOB To 950 ml of deionized H2O , add: 在950ml蒸馏水中加入 Tryptone 20 g 蛋白胨 20g Yeast Extract 5 g 酵母粉5g NaCl 0.5 g 氯化钠 0.5g Shake until the solutes have dissolved. Add 10 ml of a 250 mM solution of KCl. (This solution is made by dissolving 1.86 g of KCl in 100 ml of deionized H2O .) 搅拌均匀，然后加入10ml 250mM KCl溶液（KCl溶液配制方法：1.86g KCl 加到100ml 蒸馏水中溶解） Adust the pH of the medium to 7.0 with 5 N NaOH (~0.2 ml). Adjust the volume of the solution to 1 liter with deionized H2O . （5N NaOH 调节pH到7.0，定容到1L） Just before use, add 5 ml of a sterile solution of 2 M MgCl2. (This solution is made by dissolving 19 g of MgCl2 in 90 ml of deionized H2O . Adjust the volume of the solution to 100 ml with deionized