无菌检查法标准操作规程..docVIP

1.目的 建立要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种检查方法。 2.范围 适用于无菌检验。 3.职责 检验员按本规程操作，质量控制部主管监督本规程的实施。 4.程序 4.1 检验依据 中国药品检验标准操作规范 中华人民共和国药典二部附录Ⅺ H无菌检查法 仪器、设备 立式压力蒸汽灭菌器、数显鼓风干燥箱、净化工作台、试管、量筒、酒精灯、烧杯、电磁炉、试管架、剪刀、移液管、镊子、接种环、电子秤、培养箱、试管架、大试管若干、冰箱、移液枪等。 4.3培养基 4.3.1培养基种类及培养条件 a）硫乙醇酸盐流体培养基 30 ℃～ 35 ℃培养。 b）改良马丁培养基 23 ℃～ 28 ℃培养。 注：商购脱水培养基的每一个批号做一次培养基的灵敏度检查；每次制备的培养基应随机取不少于5支，与供试品同时进行无菌检查。 4.3.2 培养基制备 按商购脱水培养基说明配制，培养基的pH值应符合规定，否则必须校正。 4.3.3培养基及实验用具灭菌 培养基分装后放入立式压力蒸汽灭菌器中灭菌（115℃±1℃下 灭菌30min）。 实验用具根据需要采用高压蒸汽灭菌（121℃±1℃下 灭菌30min）或干燥箱灭菌（160℃下灭菌120min）。 4.4菌种 金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕 枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕 生孢梭菌( Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕 白色念珠菌( Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕 黑曲霉( Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕 4.5菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养 18小时～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23～28℃培养 24～48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu （菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养 5～7天，加入3～5ml含 0.05％（v/v）聚山梨酯 80的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（v/v）聚山梨酯 80的 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。 菌悬液在室温下放置应在 2小时内使用，若保存在2～8℃可在 24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在 2～8℃，在验证过的贮存期内使用。 4.6稀释液、冲洗液及其制备方法 4.6.1 0.1%蛋白胨水溶液取蛋白胨 1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。 4.6.2 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾 3.56g ，磷酸氢二钠 7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨 1.0g，加水 1000ml ，微温溶解，滤清，分装，灭菌。 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。 4.7方法验证试验 当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。 菌种及菌液制备除大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。 薄膜过滤法 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100 cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度培养 3～5天，各试验菌同法操作。 直接接种法 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8 管，分别接入小于 100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分