重组质粒的构建..docVIP

重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定 崔文强201300140012 同组者：陈斌，郝书平 【摘要】 重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。这就需要正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。然后利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA分子。接着将外源重组DNA引入受体细胞，所以首先要用CaCl2法制备感受态细胞，通过复制和表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状，再用红白斑筛选重组子，最后检验导入片段的大小。本次实验涉及的操作方法有很多，比如利用CaCl2制备感受态细胞的方法、热击法转化E.coli的方法、重组DNA分子鉴定的基本方法、用试剂盒提取重组质粒DNA的方法和琼脂糖凝胶电泳的方法等等。 【关键词】 重组质粒；限制性内切酶；DNA连接酶；感受态细胞；红白斑筛选；琼脂糖凝胶电泳 【引文】 外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳检验的方法进行重组子的鉴定。本实验采用单酶切法，即只能用一种限制性核酸内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端。选择具有相同限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。 重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。 还有需要注意的一点是质粒不亲和：在没有选择压力的情况下，两种亲缘密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。 【正文】 实验材料和方法 1.1实验材料 1.1.1实验器材 Eppendorf管，枪尖，枪尖盒，微量移液器，制冰机，灭菌锅，恒温水浴锅，高速离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶成像检测仪，微波炉，恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，计时器，平板，三角瓶，试管，接种环，牙签，酒精灯，火柴。 1.1.2实验试剂 琼脂糖，λ DNA，质粒pUC19，HindIII，10×M buffer，去离子水，溴酚蓝电泳上样缓冲液，TAE电泳缓冲液，氨苄青霉素母液，100mmol/LCaCl2溶液，试剂盒（含有RNase A的溶液I，溶液II溶液III 1.1.4培养基 LB培养基，麦康凯培养基 1.2实验方法 1.2.1限制性核酸内切酶及酶切反应 在0.5mLEppendorf管中依次加入酶切反应的各种成分。各管样品混合均匀后，4000rpm，1min，将液体集中于管底。37℃，1-2h，电泳检测酶切效率。 表1限制性核酸内切酶酶切反应体系 加样序号 成分 pUC19（各组） 体积（μL） λDNA（商品） 体积（μL） pUC19（商品） 体积（μL） 1 ddH2O 11.0 55.0 64.0 2 10×M buffer 2.0 7.5 8.0 3 DNA 6.0 10.0 4.0 4 HindIII 1.0 3.0 4.0 共计 20.0 75.0(50+25) 80.0(50+30) 备注1 各组一份 全班一份 全班一份 备注2 注意DNA加量：多：杂质影响；少：载体量少；在二者之间求得平衡 λDNA浓度0.35μg/μL pUC19浓度0.5μg/μL 表2酶切后琼脂糖凝胶电泳上样顺序 泳道 1 2 3 4 5 6 7 …… 15 样品 λ/HIII λDNA λ/HIII（Test） pUC19（商品） pUC19（商品）/HIII pUC19(商品）/HIII pUC19/HIII DL5000 上样量（μL） 5 5 6.0 5 5 5 10.0 5 作用 M 对照 T 对照 对照 T 1组 marker 1.2.2载体与外源DNA的连接反应 在Eppendorf管中依次加入连接反应所需的各种成分。各管样品混合均匀后，4000rpm，1min，将液体集中于管底。在16℃的恒温过夜培养。 表3连接反应体系 加样序号 1 2 3 4 5 成分 ddH2O 10×T4