实验6：DNA体外重组.ppt

基因工程实验 ——实验五：DNA体外重组 实验目的与要求 掌握体外DNA的重组过程； 学习外源DNA分子经限制性内切酶切割后与载体的连接及转化过程； 学习对DNA重组子的筛选方法。 实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项 一、实验原理 1、DNA重组简介 2、DNA连接酶 3、TA克隆 4、蓝白筛选 DNA重组是外源DNA与载体分子的连接，重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2＋、ATP存在的连接缓冲系统中，将经过酶切的或脱磷酸处理的载体分子与外源DNA分子进行连接。这样经过重新组合的DNA叫做重组体或重组子。 1、DNA重组简介 DNA重组包括如下步骤： 外源DNA片段的制备； 载体的选择； DNA片段与载体连接； 导入宿主细胞。 2种连接酶——T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。 （1）大肠杆菌DNA连接酶 仅能连接具有相同粘性末端的两个DNA分子。 2、DNA连接酶 （2） T4噬菌体DNA连接酶 不仅能连接具有相同粘性末端的两个DNA分子，还可以连接平末端双链DNA分子。 但后者连接效率比较低，一般可提高T酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 2、DNA连接酶 T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步： 首先，T4连接酶与辅助因子AMP形成酶-AMP复合物； 然后，酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化； 最后，产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。 酶最适温度为37℃ ，但该温度下粘性末端氢键不稳定，所以连接反应一般采取12~16℃ 连接过夜。 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶 目的基因与载体的连接 3、TA克隆 将3′端具有单个“A”突出末端的PCR产物克隆到3′端具有单个“T”突出末端的线性化载体的克隆法。 4、 蓝白筛选 pUC质粒载体含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lac z）的启动子（受IPTG诱导）及其编码α肽链（ β-半乳糖苷酶的氨基末端短片段）的DNA序列（特称为lac z’基因）。位于 lac z’基因中靠近5’端有一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。 受体大肠杆菌细胞的β-半乳糖苷酶发生了突变，失去的氨基末端。 当lacz’基因编码的α肽链同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突变体互补时，便会产生出有活性的β-半乳糖苷酶分子，在IPTG诱导下，会启动表达，分解X-gal产生蓝色背景。 当MCS中插入外源基因后，会阻断α肽链合成，不能形成互补，不能产生功能活性的β-半乳糖苷酶，也就不会产生蓝色背景。 所以含有重组质粒载体的克隆是白色的。 二、实验材料 l、仪器和材料 感受态细胞(如E. coli JMl09、DH5 a) 恒温培养箱，恒温摇床，恒温水浴槽，1.5 mL微量离心管（Ep管），微量取液器200 μL及20 μL吸头，电泳仪，电泳槽。 2、试剂 (1) 载体：质粒pUC l8/19 (2) 目的基因：如小牛胸腺DNA (3) 限制性内切酶：EcoRI，HindⅢ (4) T4 DNA连接酶 (5) 0.1 mol/L CaCl2溶液 (6) LB琼脂固体平板 （含氨苄青霉素） (7) 5 mL LB液体培养基（含氨苄青霉素） (8) 20 mg/mL X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷） (9) 200 mg/mL IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷） (10) 琼脂糖 (11) 无菌双蒸水 三、实验步骤 1、双酶切目的基因及载体（TA克隆法可省此步） 2、连接与转化 3、培养观察 1、连接（5μL 体系）： pEASY T3 1μL PCR纯化产物 1-4μL （Taq酶扩增） 25℃ 连接15min。 一般，载体:外源基因（摩尔比）=1:2~1:10 2、转化：10μL连接产物全用来转化200μL大肠杆菌感受态细胞。在含Amp的LB平板上，添加40 μL 20 mg/mL X-gal及4 μL 200 mg/mL IPTG，然后涂布转化后的细胞。 3、培养：37 ℃，倒置培养16h后，观察结果。计数白色和蓝色菌落。 四、预期实验结果 37℃倒置培养12~16 h后，平板上可见生长有蓝色和白色的菌落，其中白色菌落含有重组DNA，蓝色菌落含有未重组成功的质粒DNA 五、注意事项 双酶切时，注意选择合适高效的2种酶，注意双酶的缓冲液、温度的协调。 酶的加入量须小于反应体积的1/10，否则酶液中所含有甘油会抑制酶解反应。 注意连接