萌发麦苗淀粉酶活力的测定_实验选读.doc

班级：植物 学号： 姓名：刘国强：萌发麦种的淀粉酶活力的测定 淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称 本实验分为两部分一是通过纯化完成活力测定，二是不进行任何纯化处理测定总酶活力。、离心机（ppendorf 5804R） 分光光度计（ ） 托盘天平（JYT-1，原常熟市金羊天平仪器厂）2.试剂： （1）1%淀粉溶液，称取g可溶性淀粉，加入ml左右蒸馏水，在电炉上加热溶解，等冷却后，定容到ml。pH5.6的柠檬缓冲液： A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L） B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L） 取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液； （3）3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入）； （4）麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容到100ml）； （5）0.4M NaOH； 实验材料：萌发的小麦种子。 四、实验步骤 1.酶液的制备（蒸馏水浸提）： 称取2克萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置于研钵中加少量石英砂，蒸馏水作为匀浆液，研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中至40ml左右，浸提15-20分钟，用蒸馏水定容到刻度，混匀后3500转/分离心20分钟，取出上清液备用（初始酶液）。 2.α－淀粉酶活性的测定： （1）.取试管4支，注明两支为对照管，两支为测定管。 （2）.于每个管中各加入酶提取液1毫升，在70℃恒温水浴中（水浴温度的变化不应超过±0.5℃）准确加热15分钟，取出后迅速在水浴中彻底冷却。 (3).在试管中各加入1ml pH5.6柠檬酸缓冲液。 4).将测定管和对照管置于40℃（±0.5℃）恒温水浴中准确保温15分钟后，向两支对照管中各加入4ml 0.4MNaOH，再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5分钟后，向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4NaOH，然后准备下步糖的测定。 3.α-淀粉酶及β-淀粉酶总活性的测定： 取酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。混均后，取4支试管，2支为对照管，2支为测定管，各加入稀释后酶液1ml及pH5.6柠檬酸缓冲液1ml，以下步骤重复α－淀粉酶测定的第(4)步的操作。 4.麦芽糖的测定： （1）.标准曲线的制作 取15ml具塞刻度试管7支，编号，按表 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液管的制备 （2）.样品的测定 取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各1毫升，分别放入15毫升具塞刻度管中，在加入1毫升，3,5-二硝基水杨酸试剂混匀，置于沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至15毫升，混匀，用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，根据标准曲线，进行结果计算。 5.结果计算 α-淀粉酶活性（毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1）=[（A-A’）*样品稀释总体积/[样品重)*5] （α-+β-）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1）= [(B-B’)* 样品稀释总体积/[样品重)*5] A —α-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度 A’— α-淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度 B —α-及β-淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度 B’— α-及β-淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度 五、 淀粉酶活力测定液： 管号 8 9 10 11 12 13 14 15 项目 α-对照管 α-测定管 α+β-对照管 α+β-测定管 OD520 OD520均值 麦芽糖浓度（mg/ml） 结果计算： 六、/view/1462277.htm [2]α-淀粉酶的性质/experiment/430/478/480/16476.htm 思考题 1、酶活力测定实验的总体设计思路是什麽？实验设计的关键你认为是什麽？为什么？ 答：3、α-淀粉酶活性测定时70℃水浴为何要严格保温15分钟？保温后为何要立即于冰浴中骤冷？ 答：由于α-淀粉酶不耐热，在70℃下处理一定时间可以钝化，严格保温15分钟可以达到理想的钝化效果，时间过长，α-淀粉酶活性也会受到影响；时间不足，α-淀粉酶钝化不完全。保温后立即骤冷是为了通过剧烈的温变改变?-淀粉酶的结构以防止在随后的反应中复性，这样就保证了在随后的40℃温浴的酶促反应中，α-淀粉酶不会再参与催化反应。此外我认为冰浴使酶迅速降温，便于