细胞凋亡-常见问题.ppt

* 提供FITC, PE, APC,CY5,CY5.5, BD Horizon V450, BD Horizon V500等多种荧光标记的Annexin V以及纯净的Annexin V。 * Annexin V检测常见问题 1、试剂盒除了应用于人的细胞凋亡检测，是否能够检测其他物种如小鼠？ 2、贴壁细胞处理过程中或者经过固定/冻存的细胞 其细胞膜都已受到一定程度的损害，此时应用Annexin V的试剂盒所得结果不准确，建议这样的样本用免疫荧光技术进行检测，BD 亦可提供相应的荧光抗体进行检测 * * 当凋亡激活时，caspases一起水解多种蛋白底物，从而使细胞结构和功能缺失，最终导致细胞死亡。尤其是caspase-8、-9和-3都与凋亡有关：Caspase-9在线粒体通路上，Caspase-8在Fas/CD95通路上，Caspase-3位于下游，由多条通路激活。 * 免疫组化结果 * Jurkat T-Cells 喜树碱处理4hrs或者小鼠胸腺细胞 Fas 抗体刺激诱导6hrs的检测结果。 M1阴性界限划分完全是根据阴性对照。Casapase -3 活化的细胞数量显著增加（5%--52% ，1%--45%） * 细胞凋亡晚期，核酸内切酶活化，DNA双链发生断裂，出现不对称断裂点（即3’ OH ）（3’ OH暴露），TdT（末端 脱氧核苷酸 转移酶）可催化Br-dUTP与暴露的3’ OH结合，通过针对BrdU-的荧光标记抗体进行检测。 Bromylated deoxyuridine triphosphate (Br-dUTP) 未凋亡的细胞因为没有暴露的3端，所以不会被检测出 * TdT介导的dUTP缺口末端标记法 （TUNEL） * 长半小时 阳性率更高，更准确。 Caspase-3 data（FCM） Jurkat T-Cells Mouse Thymocytes FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit Cat No. FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit 550480 PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit 550914 Caspase-3 Kits PARP cleaved –Caspase 3水解产物 PARPs：一类由DNA链断裂而被激活的DNA 修复酶。PARP可以被Caspase-3水解成两个大小分别为24-和89-kDa的片段而失活 PARP cleaved是凋亡细胞中活化的Caspase-3水解产物，代表Caspase酶失去活性 细胞凋亡的标志 Hela 细胞 A. 未处理组 B. 星孢菌素处理组裂解的PARP cleaved阳性 Jurket细胞用不同浓度的喜树碱处理结果 PARP cleaved –Caspase 3水解产物 化疗前后胃癌活检标本中PARP Cleaved+细胞 4. 细胞核DNA检测 ? 凋亡晚期 DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成~185bp为基数的有序片段。 检测方法 Tunel流式法:通过在核酸片段末端标记计算凋亡百分比 末端转移酶标记技术 细胞核DNA检测原理：APO-BrdU TdT: 脱氧核糖核苷酸末端转移酶 Brd UTP的渗入率显著高于dUTP，因此检测灵敏度高 TUNEL法: 流式分析晚期凋亡 APO-DIRECT? KIT 50 tests cat. 556381 Part A (store at 4℃) ? Part B (store at －20℃) PI/Rnase staining buffer ? FITC-dUTP Reaction buffer ? Negative control cells Rising buffer ? Positive control cells Wash buffer ? TdT Enzyme 一步法 实验用2种染料 PI染色总DNA：得到细胞周期的信息； FITC-dUTP染色凋亡细胞：检测凋亡。 在流式细胞仪488nm激发下，PI发射约623nm荧光，FITC发射520nm荧光。 APO-BrdU? KIT 60 tests cat. 556405 Part A (store at 4℃) ? Part B (store at －20℃) FITC-Labeled Anti-BrdU mAb ? Br-dUTP PI/Rnase staining buffer Reaction buffer ? Negative control cells Rising buffer ? Positiv