第五章体外培养的基本技术要点分析.ppt

胰蛋白酶消化细胞法如下：    培养基：自制适应性培养基→是一种不含 细胞而已被细胞生活过或同化过的培养基。 选取同源指数生长期细胞（半汇合） 换培养液1次 继续培养24～48h后，吸取所有培养液 3000-4000rpm，离心10min ③? 提高克隆形成率的措施 上清用0.22μm微孔滤膜过滤（避免形成假克隆），低温冻存备用 用时取1份适应性培养基+2份新 配制培养基混合使用 血清：胎牛血清→小牛血清→马血清，灭活处理56℃，0.5h. 应先做克隆形成率实验，选最佳者使用。 激素：含1～10u/ml的胰岛素培养液能促进很多 细胞克隆的形成。 CO2：CO2对绝大多数细胞克隆形成率都有提高，多用5%，成纤维细胞和胶质细胞2%. 饲细胞（Feeder cells）：也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。失去分裂能力，但仍然生存并有同化营养液的能力。 饲细胞制备后三周内即死亡，应及时应用。 饲养层克隆培养 适应性底物： 无限细胞系→塑料底物； 原代培养细胞→胶原层或血浆纤维蛋白层。 病毒转化细胞或恶性细胞 → 琼脂层（2%），恶变细胞或恶性转化细胞在软琼脂（1.2%）中的 生长与致瘤性有很大一致性。 ④ 方法（多孔塑料培养板单细胞克隆法）： 48孔或96孔塑料细胞培养板 （培养6～12h后）镜下检测每孔所含细胞数，标记下含单细胞孔 制备低密度的细胞悬液（10个细胞/ml） 每孔接种100μl细胞悬液 37℃培养 标记孔细胞增殖成群即为细胞克隆 继续培养3-4周，待孔内细胞增至500-600个时，进行分离培养 扩大再培养 ⑤ 注意事项： 确为一个细胞后方可进行标记 注意观察孔底边缘部位 选健康细胞的孔标记 细胞克隆培养的其他方法: 软琼脂培养、甲基纤维素半固体培养、有限稀释法  4．悬浮培养法 ：使贴附性细胞呈悬浮状态 生长。 ①? 悬浮生长型：离心去除旧培养液→添加 新培养液→混匀分装即可 ② 贴附生长型：干扰细胞贴附，方可形成 悬浮生长状态。 常用方法：a.大培养瓶增加含有铁芯的无毒聚 苯乙烯棒，培养中进行电磁搅拌。 b.试管培养细胞，把试管置入带有 悬转鼓的温箱中培养。 5.球体细胞培养 能使培养细胞长成球体型，球体中心部细胞吸收营养和排出代谢产物要通过外围细胞，周边部细胞却是直接的，两者生存条件不同，与肿瘤组织和体内上皮组织情况相似，对研究细胞分化很有价值。 6.微载体细胞培养法 可获得大量细胞。目前使用的载体主要有三种类型，都是带有不同基团的葡萄糖交联而成的大分子，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。对细胞无毒性，适于各种附着型细胞的生长，尤其是附着性差和存活率低的细胞。 1. 消化培养法 ? 主要用品： 人或动物的新鲜组织 0.25%胰蛋白酶 Hanks液 含10%～20%牛血清的培养液 眼科剪刀、眼科镊 吸管、培养皿、瓶和不锈钢筛网、计数板等。 初代细胞培养主要方法： 流程：（注意无菌操作） 1～5cm3新鲜组织用Hanks液漂洗2～3次 眼科剪将组织剪成约1mm3的小块 加30 ～ 50倍原组织块的0.25%胰蛋白酶液 温消化37℃，1～4h 或 冷消化4 ℃ ， 6～24h 不锈钢网滤过除去大块组织 所得细胞悬液500～1000rpm低速离心，5min 弃上清，加适量营养液（含血清），吹打均匀制成细胞悬液 计数（5×105个/ml），细胞密度过大时，补加营养液调整 37℃培养，注意PH值（7.2 ～ 7.4） 冷消化 例：乳鼠肾细胞原代培养 （1）准备工作： ? 培养用品消毒后，放在超净工作台内 紫外线消毒，做好各项准备工作. ? 点燃酒精灯，用品按布局放置，安装 吸管等 ? 采用颈椎脱臼法，将一只新生乳鼠