miRNA实验技术及与肿瘤关系进展要点分析.doc

miRNA实验技术及与肿瘤关系研究进展 The Research Progress of miRNA experimental technique and carcinoma 摘要 miRNA是一类新近发现的内源性非蛋白编码的单链小分子RNA，长度约为20-25 nt，广泛存在于真核生物中。在人类已发现的300多个miRNA中有许多与肿瘤的发生有着密切的关系，研究人员通过实验手段和生物信息学方法研究了一些miRNA与肿瘤的关系，以期望寻找到治疗肿瘤的新方法。 关键词：miRNA；肿瘤； miRNA抑制；miRNA过表达；生物信息学 1.miRNA概述 miRNA是一类新近发现的内源性非蛋白编码的单链小分子RNA，长度约为20-25 nt，广泛存在于真核生物中，进化上相对保守，具有时序性和组织特异性。1993年 Lee等[1]在对秀丽新小杆线虫（C-elegans）进行突变体的遗传分析中首次发现非编码蛋白质能时序调控其胚胎后期发育基因表达的RNA：Lin-4。2000年Reinhart [2]在线虫中发现了另一种重要的具有转录后调节作用的miRNA：let-7,从而拉开了miRNA的研究序幕。成熟的miRNA在5’端有-HP04基团，3’端具有-OH基团，二者可以和上游或下游的序列不完全配对形成茎环结构，其转录独立于其他基因，本身不具有开放阅读框架，不编码任何蛋白质。miRNA通常是由RNA聚合酶Ⅱ转录，最初产物为前miRNA(pri-miRNA)的大前体分子，在胞核内被处理成约70个核苷酸的前miRNA(pre-miRNA)，输送到胞质后被剪切产生22—25个核苷酸的双链miRNA，双链miRNA很快被整合到miRNA诱导的沉默复合体中，其中一条miRNA链被解旋酶所降解，另一条成熟miRNA以单链形式存在，保留下来的miRNA具有调节基因表达的功能。但现在有研究发现两条miRNA均有可能保留下来，但作用点有区别[3]。就目前研究成果所知的miRNA作用机理主要是指miRNA的2-8nt的序列可与靶基因3’UTR序列配对，从而抑制基因的表达，影响蛋白表达水平。据推测，miRNA可能调控着人体基因组1/3以上基因表达。 2.miRNA功能研究方法 研究表明，miRNA在发育、细胞增殖、凋亡、脂类代谢、激素分泌及肿瘤发生等多种生理和病理过程中发挥重要作用。针对miRNA的研究方法主要包括两大类：一是以传统实验技术方法为基础建立起来的miRNA特有的技术方法，二是已成熟应用的生物信息学技术。前者侧重于miRNA表达的检测和功能机制的阐明，后者则包括新miRNA基因及miRNA靶基因的预测。在miRNA研究的初期,生物信息学方法发挥了非常重要的作用,Ambros 等通过编写相关程序及同源比对从包括人和小鼠在内的多种生物中，预测了大量miRNA分子，并在之后的实验研究中得到验证。从此，生物信息学方法广泛应用于从线虫到果蝇、小鼠、大鼠、鸡、人等多种动物和植物的miRNA分子预测和鉴定[4] 。而由传统琼脂糖凝胶电泳Northern 杂交发展而来的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)Northern 杂交则是鉴定新miRNA分子和获得miRNA表达证据的通用关键技术。 2.1.miRNA的实验技术方法 具体而言，无论miRNA在某种肿瘤细胞中起到何种作用，首先要探测到该miRNA的存在，传统的方法是northern blot，随后发展的有实时定量PCR等，确认某种miRNA后，要研究其是扮演促进或抑制的角色就需要运用miRNA的抑制和过表达技术。 2.1.1.miRNA抑制 目前,主要有两种方法可以阻断miRNA的作用：一是敲除miRNA基因或其在靶基因上的结合位点；二是miRNA的序列特异性抑制。然而,由于分子大小的限制,miRNA基因直接敲除的方法并不实用。 所以,研究者多使用2′-氧甲基化修饰的反义寡核苷酸抑制剂来阻断miRNA的作用[5]。这种抑制剂是体外化学合成,能与特异性miRNA完全互补的反义RNA ,其核糖2′-氧的甲基化修饰能保证反义RNA 分子在体内的稳定性，在借助转染试剂进入目的细胞后,能快速并稳定地与内源性成熟miRNA分子互补结合,从而阻止了内源性miRNA分子与靶基因配对。该类抑制剂的转染试剂以Ambion 公司的NeoFXTM为代表。目前,这类抑制剂的应用仅限于体外培养的细胞,还不能在动物体内使用。现在,化学合成的2′- 氧甲基化修饰的寡核苷酸分子可带有一个3′端的氨基接头,用于与非核苷酸分子(例如:生物素等) 的连接。这种与标记物相连的寡核苷酸也可用于miRNA的检测,并可用于与miRNA作用的细胞因子的分离。有研究表明，在黑色素细胞瘤中特异性miRNA-26a抑制剂能够增加SODD的表