石蜡切片免疫组化步骤介绍.doc

石蜡切片免疫组化步骤 石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值，最后定容在1000ml 用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵；二、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片放在60恒温箱中烘烤2h以上， 然后按以下流程进行：二甲苯（1h）、二甲苯（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min）2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。4、抗原热修复：将切片置于装有抗原修复液的玻璃容器中（耐高温），进入微波炉内，容器内液体温度达到95～100后断电，连续三次。5、PBS冲洗5min×3次。6、5%BSA封闭液20min，甩去。7、用0.1mol/L PBS稀释一抗100倍，滴加后4过夜。8、 PBS冲洗2min×3次，滴加二抗37 20min，PBS冲洗2min×3次，滴加SABC 37 20min，PBS冲洗5min×4次，显色剂显色。9、自来水冲洗，封片，观察。注意：如果需要做双标记法，则在操作完步骤8后，重复步骤3～8即可. 评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。1、方法操纵不难，最大的易处是出现非常后果时怎样处理?这就需要把握免疫组化实行道理，每步晓得为何这样做，这样你才敢斗胆地变革先前的不合错误的方法步骤。如抗体孵育条件次要是抗体浓度、温度、时间，这三者通常为互相成反比的(相对)，此中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速率、时间决定反应的量。就拿温度来讲，可以有4度、室温、37度，我保举4度最好，反应最暖和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太倡导，除非你每次都把情况温度掌握在必然的范畴，不然，尽可能选择前两者。2、免疫组化最大的上风是定位和定性。比拟于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵活度高、定位较直接正确，是定位检测分析尾选方法。特别对于有些因子的转位研究十分有效。3、免疫组化结果定量分析的条件是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们平常审稿时鉴定研究结果的必备条件。4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对比通常为用必定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替换一抗来进行反应，其他步骤均一致。前者是解除方法和实验体系有无问题；后者是扫除有无一抗外的非特异性染色。5、免疫组化的应用普遍，是当前实验研究的最重要方法之一。现在发SCI论文时，显着觉得仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分接待，多是怕你学术造假吧。固然也不能做假阳性或假阴性结果。6、免疫组化技术掌握与否的审定尺度是同统统片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出良好的染色切片。我在日常平凡带教中就发现很多研究生把我已经摸索很成生的反应条件、浓度、方法步骤，反复使用于同一性子的切片和同一种抗体，做出来后就感觉本人已经把握了免疫组化方法，调换一种抗体后，竟然连二抗的种属来源都拿错了。失利常常促进你去思测验验原理和过程，乐成有时也加速你自负。1、观点战经常使用办法先容1、界说用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的漫衍和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学(immunohistochemistry)技术或免疫细胞化学(immunocytochemistry)技术。2、原理按照抗原抗体反应和化学显色道理，组织切片或细胞标本中的抗本来和一抗结合，再操纵一抗与标识表记标帜生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用符号辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如链霉亲和素等)结合，最后通过呈色反应或荧光来显现细胞或组织中化学身分，在光学显微镜或荧鲜明微镜下可清楚瞥见细胞内产生的抗原抗体反应产品，从而可以在细胞爬片或组织切片上原位肯定某些化学成分的散布和含量。3、分类1)按标记物质的种类，如荧光染料、