生物技术大全介绍.doc

一细胞培养技术过程： 复苏1. 把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。2. 把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。3. 把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。4. 标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。5. 3天换一次培养基。二、 传代1. 培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。2. 把原有培养基吸掉。3. 加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。4. 细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。5. 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。6. 把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。7. 倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。8. 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。三、 冻存把细胞消化下来并离心（同上）。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。冻存液的配制： 70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。要注意的就是无菌操作！ PCR技术操作程序和优化方法 典型的PCR操作? ?? ?(一)??试剂? ?? ? (1)引物根据待扩增DNA不同，引物亦不同。? ?? ? (2)耐热DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温(93—100)。? ?? ? (3)10x PCR缓冲液：??500mm01／L KCl；??100mmol／L Tris一HCl(pH8.4，??20)，150mmol／L MgCl2，??lmg／m1明胶。? ?? ? (4)5mmo1／L dNTP贮备液：将dATP，dCTP，dGTPT和dTTP钠盐各100mg合并，加3m1灭菌去离子水溶解，用NaoH调pH至中性，分装每份300v1， (-) 20保存dNTP浓度最好用uv吸收法精确测定。另外。现在已有中性dNTP溶液商品供应(Sigma公司和Pharmacia公司等).? ?? ? (5)标本处理试剂：不同标本所需试剂不同，根据具体情况而定.? ?? ? (二)??操作程序? ?? ?利用PcR扩增的操作程序基本相同，只是根据引物与靶序列的不同，选择不同的反应体系与循环参数(见本章第：：节)o基本的操作是将PcR必需反应成分加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。每个实验室或每个人都有不同的操作习惯，但需遵守一定的操作规范。? ?? ?我们推荐下述操作程序，因这样操作可最大程度地增加反应的成功率。? ?? ?(1)向一微量离心管中依次加入：? ?? ?ddH20? ? 补至终体积(终体积50~100ul)? ?? ?10 x PCR缓冲液? ? 1／10体积? ?? ?dNTP? ? 各200umol／L? ?? ?引物? ? 各1umol／L? ?? ?DNA模板? ? 10*10一10*10*10*10*10拷贝? ?? ?混匀后，离心15s使反应成分集于管底。(2)加石蜡油50—100ul于反应液表面以防蒸发。置反应管于97c变性7min(染色体DNA)或5min(质粒DNA). ? ?? ?(3)冷至延伸温度时，加入1—5U Taq DNA聚合酶，在此温度作用1min.? ?? ?(4)于变性温度下使模板DNA变性适当时间。? ?? ?(5)在复性温度下使引物与模板杂交一定时间。? ?? ?(6)在延伸温度下使复性的引物延伸合适的时间。? ?? ?(7)重复(4)一(6)步25—30次。每次即为一个PcR循环o? ?? ?(8)微量琼脂德凝胶电泳检查扩增产物(见本章第7节)o? ?? ?上述过程可以用PcR自动热循环仪进行，也可以设定3个恒温水浴锅手工操作.第二节??PCR条件的优化? ?? ?PCR必需具备下述基本条件：模板核酸(DNA或RNA)；人工会成的寡核苷酸引物；合适的缓冲体系；Mg2+；三磷酸脱氧核苷酸；耐热DNA聚合酶；温度循环参数(变性、复性和延伸的温度与时间以及循环数)o另外，还有一些其它因素，如二甲基亚砜、甘油、石蜡油、明胶或小牛血清白蛋白等也影响某些特定PCR。下面分别讨论这些因素