有机污染物高效液相色谱分析技术-紫外-可见光检测器分析酚类化合物.docxVIP

有机污染物高效液相色谱分析技术-（1）紫外-可见光检测器分析酚类化合物一、实验目的1、掌握高效液相色谱分析法中的基本原理（包括分配分离原理、紫外-可见光检测器检测原理）；2、基本了解高效液相色谱（1200LC）组成结构，硬件操作及掌握化学工作站的开机，关机，参数设定，数据采集及分析的基本操作；3、了解紫外-可见光检测器的基本原理及其适用范围；4、掌握高效液相色谱定性、外标定量方法。二、实验原理液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。高效液相色谱仪以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。对于酚类化合物的测定，其基本原理是这样的：先用固相小柱吸附水中酚类化合物，然后用溶剂洗脱，经氮吹气浓缩至一定体积 后，用反相高压液相色谱法分析。在反相色谱柱上以甲醇/（水+乙酸）为流动相把经预处理的酚类化合物分离，用紫外检测器，测定各种酚的峰高或峰面积，以外标法定量。分配色谱原理：主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。1、高效液相色谱的组成结构及各部分作用（1）四元泵：混合、脱气作用。四元泵真空脱气机由一个四通道（有四个管状塑料膜）真空箱和一个真空泵构成。打开真空脱气机的电源开关后，控制电路即开启真空泵，真空泵运行使真空箱内产生部分真空。真空度由压力传感测定，根据传感器信号，真空脱气机通过运行或关闭真空泵来维持真空度。（2）自动进样器（3）柱温箱：（4）UV-VIS检测器（5）C18色谱柱：分离样品中的各个物质。流动相——真空在线脱气机——四元比例阀——主动输入阀——泵头——出口单向阀——压力阻尼器（侧压力）——泵头——排液阀——自动进样器（其冷凝水排水管必须高于收集瓶，不能浸在液体里。其下有一控温模块，定量环标配100ul，一般进样量5ul-50ul较好）——柱温箱——紫外监测器（流通池）——荧光检测器（一定要荧光串联在紫外之前，因其流通池耐压20bar，紫外可耐压40bar）2、工作过程Agilent 1200 LC液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相（经过在线过滤器）以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。3、紫外-可见光（UV-VIS）检测器基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS 对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长。（Agilent 1200 UV-VIS检测波长范围为190nm-600nm）4、外标法定量外标法是色谱分析中一种简便的定量方法。当样品中所有组分都得到良好的分离并都能被检测而得到色谱峰时，则可利用外标法定量计算样品中各组分的浓度。其定量的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。数据处理软件（工作站）可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。一般由被测物所配标准浓度与峰面积做标准曲线，由标准曲线求出被测物浓度。5、液相色谱分离模式（1）正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。（2）反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。表1 正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高～中中～低流动相极性低～中中～高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出三、仪器及试剂1、仪器Agilent 1200 HPLC（四元泵、自动进样器、柱温箱、 UV-VIS检测器、C18色谱柱（4.6*150mm，5um）)，稳压电源。2、试剂色谱级甲醇；Miniport超纯水；含3个酚类化合物的标准样品；实际测试水