(实验2酶切片段回收和连接.docVIP

酶切、片段回收与连接 黄华如 （生命科学学院，生技091，29号） 摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。 关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收 基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。使用缓冲液或缓冲液制作琼脂糖凝胶，然对目的进行琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下切出含有目的琼脂糖凝胶用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高回收率。胶块超过请使用多个进行回收否则严重影响收率。注）切胶时请注意不要将长时间暴露于紫外灯下，以防止损伤。 凝胶浓度 Buffer GM使用量 1.0% 3个凝胶体积量 1.0%-1.5% 4个凝胶体积量 1.5%-2.0% 5个凝胶体积量 均匀混合后室温15-25℃融化凝胶。此时应间断震荡混合，是胶块融化（约5-10分钟）。 当凝胶完全融化后，观察融胶液的颜色，如果融胶液颜色有黄色变为橙色或粉色，向上述胶块融化液中加入10ul 3 M醋酸钠溶液（pH5.2），均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。 将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。 将700ul 的Buffer WB 加入Spin Column中，室温12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。 重复操作步骤10。 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000rpm离心1分钟。 将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30ul的灭菌蒸馏水或Elintion Buffer，室温静置1分钟。 室温12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。 2.4 T4连接酶连接 表三：T4连接酶连接体系 试剂 用量 回收pet质粒 4ul 回收bt2质粒 4ul T4 连接酶 1ul T4 Buffer 1ul 总 10ul 放置4°C连接过夜 2.5 转化大肠杆菌 质粒DNA转化大肠杆菌方法： 把感受态细胞置于冰中； 把50ul的感受态细胞转至连接的DNA中（10ng一下，昏匀）； 冰中放置30分钟； 42°C放置45--60秒； 冰中放置2--3分钟； 加入37°C预热更好的soc培养基，使终体积1ml； 37°C振荡培养1小时（160--225r） 取适量的菌液涂布琼脂糖培养基 37°C过夜培养 2.6 验证（PCR） 表四：验证PCR体系 试剂 用量 10xBuffer 2ul dNTP 2.5ul 引物1 0.5 引物2 0.5ul Taq酶 0.5ul 加蒸馏水至 25ul PCR条件：94℃4min，94℃45s，51℃45s，72℃1m30s，30个循环，72℃10m。 （M：Maker2000；B：bt2质粒；P：pet质粒；1，2，3···：每组实验） 图1 两种质粒的双酶切结果 在图1中可以清晰的看到，bt2质粒被酶Bam1HI和酶HindIII切成两条带，而pet质粒则被切成一条带，在bt2质粒中，第一条较粗的带为目的基因，第二条是双酶切切除目的基因后剩下的基因；在pet质粒中，可以看到的只有一条带，其实在双酶切下，pet质粒也会有两条带的，只不过是切完后的两段片段的质量差不多，在电泳的时候没能跑开来。由于bt2和pet质粒都是用相同的两种酶剪切，所以在在bt2质粒和pet质粒剪切下来的目的片段和载体片段都形成了相同的粘性末端。我们每组的结果都很清晰很成功，只要成功的地方很有可能是bt2质粒和pet质粒的质量都非常高。 3.2 转化大肠杆菌结果 图2 质粒DNA转化大肠杆菌 图2中可以清晰的看到白色的斑点，转化的大肠杆菌。由于目的基因中含有一些抗性基因，如，Amp、潮霉素等，而在培养基中也加有这如Amp、等的抗生素，能在培养基生长