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普通生物学实验（三） 教 案 目 录 35、细菌的简单染色、革蓝氏染色……………………………………………………………3 36、细菌的芽孢、荚膜、鞭毛染色鉴定及运动性观察………………………………………5 37、微生物细胞形态及菌落特征观察…………………………………………………………11 38、培养基制作、灭菌与无菌操作接种技术………………………………………………… 19 39、微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数…………………………………………………35 附：微生物的菌种保藏……………………………………………………………………………41 40、微生物鉴定中常用的生化反应……………………………………………………………45 附：微生物自动鉴定仪鉴定………………………………………………………………………48 41、微生物细胞大小测定及显微镜直接计数 ………………………………………………51 42、乳酸菌分离及食用乳酸制作 ……………………………………………………………55 ①乳酸菌分离与鉴定……………………………………………………………………………55 ②食用乳酸制作…………………………………………………………………………………55 43、微生物营养和环境条件设计实验 ………………………………………………………57 44、水体中微生物检测 …………………………………………………………………62 ①水体中细菌总数的检测………………………………………………………………………62 ②水体中大肠菌群的检测………………………………………………………………………65 参考文献…………………………………………………………………………………………68 实验三十五 细菌的简单染色及革兰氏染色 一、实验目的与要求 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法； 学习显微镜油镜观察的方法； 进一步学习并掌握无菌操作技术要点。 二、重点与难点 在取菌涂片的过程中怎样操作才能保证斜面菌种不受到污染？ 2、革兰氏染色实验中首先是涂片的厚薄会对结果有很大影响；其次是在媒染1min后一定要用水洗去碘液，此步不可以省去；第三脱色20～25s应立即水洗。 三、教学方法与手段 本次实验课主要采取讲授法和演示法,辅以视频影象资料进行教学。 四、实验内容 细菌的简单染色； 细菌的革兰氏染色。 五、实验原理 　　用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿）等使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 　　简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 　　革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（C+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G＋菌和G－菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G＋菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 六、实验材料 1、活材料：培养12～16h的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），培养24h 的大肠杆菌（Escherichia coli）。 2、染色液和试剂：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、番红、复红、二甲苯、香柏油。 七、实验用品 废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、滴管、玻片搁架、镊子、洗瓶、香柏油、无菌水、生物显微镜等。 八、实验方法 （一）简单染色 1、涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金芽胞杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块，挑刚制成的苏云金芽胞杆菌浓菌悬液2～3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取