(实验报告硫酸铵法实验报告例.docVIP

《生物技术制药概论》综合性实验 “动植物超氧化物歧化酶SOD的制备” 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）可能与机体衰老、肿瘤发生、自身免疫疾病和辐射防护有关，是一种重要的蛋白质类药物，可用于炎症、类风湿关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症等。SOD存在于动、植物、微生物中，有Cu-Zn-SOD,Mn-SOD,Fe-SOD等多种形式存在。植物SOD的研究今年来引起了科学家的特别重视，因为SOD具有清除体内过量的超氧自由基（O2-）的功能，对于预防衰老、血管硬化等有显著效果，对疾病的治疗也初步显出疗效；植物来源的SOD稳定性较动物来源的好，特别是类-SOD，因相对分子量较小，易透性好，引起保健品、美容品方面的特别重视。比较好用的品种有刺梨、茶叶等植物的SOD。此外，植物SOD酶在农业新品种培育研究中也有重要意义。 该综合性实验涉及本科程动物细胞制药、植物细胞制药及酶工程制药。实验过程综合了药物制备的重要步骤，如：收集、植物干粉制备、丙酮抽提、清洗、溶血、去血红蛋白、沉淀、热处理、分离、透析浓缩、蛋白质类药物的纯化技术、酶类药物的活性测定等。 实验目的 通过本实验学习，使学生掌握生物技术制药的重要章节：动物细胞制药、植物细胞制药、酶工程制药，提高学生运用知识、对理论知识的应用等综合能力。 实验原理 将动植物材料用不同的方法进行细胞破裂后用缓冲液浮洗，再用乙醇、氯仿去除杂质沉淀，在硫酸铵、丙酮作用下使SOD沉淀；最后进行溶解，并用透析、柱层析（DEAE-Sephadex A50;Sephadex G-100;DEAE-cellulose）的方法进一步纯化，得到SOD纯品。 实验步骤 3.1 实验材料： 新鲜桑叶、硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 3.2 实验步骤： A、粗提 （1）桑叶→大量清水洗涤干净→蒸馏水洗涤→滤纸吸干称g→研磨机研磨→过滤→上清液→测定体积（V1） （2）上清液→60℃水浴20min（去杂蛋白）→10000r/min冷冻离心20min →上清液→测定体积（V2） B、纯化（硫酸铵分级沉淀法） 按A的体积查出0℃达到一定饱和度需加入的硫酸铵的质量 50%饱和度 4℃ 30min ↓ 10000r/min 20min 上清液 ↓ 90%饱和度 4℃ 2h ↓ 10000r/min 20min 沉淀 5mmol/L PH7.8PBS C、按表中试剂用量加入试管并在25?C保温25min。 solution blank control sample PH8.3PBS 4.7ml 4.7ml 4.5ml HCl 10μl SOD sample 0.2ml 邻苯三酚50mmol/L 10μL 10μL V总 4.7ml 4.7ml 4.7ml D、活力测定： 将样品溶液倾入1 cm 的比色杯中,在325 nm 处每隔30 s 测定吸光度1 次,选择时间范围,控制对照管每分钟吸光度的变化速率在0.070 左右,记录样品溶液每分钟` 。 酶活力的计算:SOD 活力(U·mg - 1 ) = (0.070 - △A325 ) ×100 % ×V总÷0.070 ×50 %·V定义·V样。其中: V总代表反应总体积,V样代表加入样品液的体积,V定义代表活力单位定义体积(1 ml) 。 实验数据和实验结果 2、粗过程： 实际加入缓冲液体积：ml V1：ml V2： （2）分别稀释 0.711倍 （3）测定前再稀释倍 3、酶活力测定获得两组数据： x2 x3 x4 （未测出） 即△A325 x1 x2 x3 x4 （未测出） 即△A325 将以上数据带入公式：SOD 活力(U·mg - 1 ) = (0.070 - △A325 ) ×100 %