细胞凋亡、细胞周期.ppt

1. 细胞膜变化的检测：Annexin V/PI 磷脂酰丝氨酸 (PS) 的检测：早期凋亡 早期凋亡PS检测及结果判定 早期凋亡特征： 磷脂膜(PS)外翻，但是细胞膜保持完整性，因此PI染色为阴性 DNA没有发生断裂 早期凋亡PS检测及结果判定 Annexin V-FITC PI 细胞膜变化的检测：Annexin V/PI 优点：简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞 样本设置： 1. 空白对照：辅助判断管，即不加Annexin V/PI，但用它调电压的话，电压偏高，即根据它确定的阴阳性界限是偏低的。 2. 单阳样本：诱导凋亡，Annexin V单染，用来调补偿 3. 单阳样本：诱导凋亡，PI单染，用来调补偿 注意事项： 1. 细胞制备或储存时细胞膜损伤，造成假阳性 2. 贴壁细胞消化时避免使用EDTA，螯合钙离子 BD Annexin V 流式检测试剂盒 Kit Cat no. Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit I 556547 Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit II-Contains unlabeled recomb. Annexin V 556570 Annexin V:PE Apoptosis Detection Kit I 559763 提供FITC, PE, APC,CY5,CY5.5, BD Horizon V450, BD Horizon V500等多种荧光标记的Annexin V以及纯净的Annexin V。 Annexin V检测常见问题 1. 是否 Annexin V Kits 可以检测小鼠或其他物种? Annexin V试剂盒可以检测多种属 2. 这个试剂盒是否可用于贴壁细胞、固定或冻存的细胞、或组织? No. 上述样本的细胞细胞膜都会或多或少受到损害，这样的样本建议用免疫荧光技术 (Cat. No. 550911) 3. 是否与细胞表面标记兼容? CD11B/MAC-1 LY-71 只要Ca离子不影响该表面Marker就可以同时做 2. 线粒体水平的检测 激活Caspase 9—激活Caspase 3—启动细胞凋亡 凋亡与线粒体膜电位的去极化相关 BD Mitoscreen (JC-1) Cat# 551302 25 tests JC-1: 可穿透细胞膜的亲脂性阳离子荧光素 原理： JC-1在正常细胞中以聚合体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光（FL-2 Channel）； 细胞凋亡时，线粒体膜电位发生去极化，膜电位降低，JC-1 以单体形式存在于胞浆内，荧光 强度减弱甚至消失 （只能在FL1通道检测到），故用荧光信号的变化判别凋亡的发生。 操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟后检测 2. 线粒体水平的检测 JC-1检测结果流式图 JC-1 (Fl-1) Jurkat T Cells Mouse Thymocytes Control Staurosporine Camptothecin Fas mAb R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2 Control JC-1 (Fl-2) 3. 凋亡相关酶的检测- Caspase ? 背景知识 – 细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶） – Caspase 3是参与DNA维护和调控细胞的重要组分，即Caspase 3激活==细胞凋亡 – 检测原理：是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的Caspase活性。 Jurkat T-Cells 6 μM camptothecin for 4 h untreated Caspase-3 data（IHC） Caspase-3 data（FCM） Jurkat T-Cells Mouse Thymocytes FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit Cat No. FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit 550480 PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit 550914 Caspase-3 Kits 4. 细胞核DNA检测 ? 凋亡晚期 DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成~185bp为基数的有序片段。 检测方法 Tunel流式法:通过在核酸片段末端标记计算凋亡百分比 末端转移酶标记技术 细胞核DNA检测原理：APO-BrdU TdT: 脱氧核糖核苷酸末端转移酶 Brd UTP的渗入率显著高于dUTP，