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* Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 第二节、基因工程的基本操作步骤 二、基因工程的基本操作步骤 目的基因的获取 重组DNA的形成（基因表达载体的构建） 将重组DNA导入受体细胞 目的基因的检测与表达 基因工程操作步骤： 1.第一步：获取目的基因 （1）方法： ①从基因文库中获取目的基因 ②利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因（目的基因的序列已知） ③人工合成目的基因（目的基因的序列已知） 从基因文库中获取目的基因 将总DNA经过酶解，分离不同长短的DNA片段。包含的基因片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因文库。 利用PCR技术扩增目的基因 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。 利用PCR技术扩增目的基因 人工合成 基因的方法 直接合成DNA（已知核苷酸序列） 反转录法 （已知氨基酸序列） 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 目的基因 逆转录 载体 限制性内切酶 同种限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 目的基因 2.基因表达载体的构建 扩展 用两种限制性内切酶的好处是？ 如果用一种限制酶 3.将重组DNA分子导入受体细胞 转化 3.1常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 a将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 b将目的基因导入动物细胞 显微注射技术（最多、最有效） c将目的基因导入微生物细胞 Ca2+处理，以增加细菌细胞壁的通透性。 花粉管通法 3.2目的基因导入细胞途径 农杆菌转化法 显微注射技术 提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵 受精卵移植 将目的基因导入微生物细胞 处理细胞→ 细胞→表达载体与感受态细胞混合→ _________细胞吸收DNA分子。 Ca2+ 感受态 感受态 举例 ：载体含有抗四环素基因 受体细胞 接种 没有菌落 细胞生长 （不含重组DNA分子) 有存活的受体细胞或菌落 （含重组DNA分子) 含四环素培养基的平板 四环素抗性基因 4. 目的基因的筛选和表达（筛选含有目的基因的受体细胞，目的基因的表达） 浙科版 DNA分子杂交示意图 4. 目的基因的筛选和表达（筛选含有目的基因的受体细胞，目的基因的表达） 第三节基因工程的应用 1.转基因植物 一、基因工程与遗传育种 获得高产、稳产和具有优良品质的农作物 培育具有各种抗逆性的作物新品种 第三节 基因工程的应用 2.转基因动物 培育品质优良的动物 培育有特定外源基因的哺乳动物 1. 基因工程药物 二、基因工程与医药卫生 “工程菌”方法 胰岛素：大肠杆菌 干扰素：大肠杆菌及酵母菌 白细胞介素-2：大肠杆菌 2.基因治疗 向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正和补偿基因的缺陷，达到治疗的目的 例：重度免疫缺陷症的基因治疗 目的基因：腺苷酸脱氨酶基因 浙科版 P12 基因治疗SCID(复合免疫缺失征)的过程 2.环境监测 三、基因工程与生态环境保护 1.净化被污染的环境： 分解、降解有毒、有害物质 “超级菌” 基因工程与环境污染治理 基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。 通常一种假单胞细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。 基因工程与环境监测 利用基因工程培育的指示生物能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。 补充：蛋白质工程 蛋白质工程是在基因工程 的基础上发展起来的， 是现今科学研究的新热点。 蛋白质工程的定义 蛋白质工程主要是改造现有的蛋白质，通过修改蛋白质中氨基酸序列来改进蛋白质的结构和构象，提高蛋白质的活性、稳定性和产率。 基因 DNA mRNA 氨基酸序列 多肽链 蛋白质 三维结构 生物功能 预期功能 中心法则 蛋白质工程 DNA 合 成 分子设计 转录 翻译 折叠 蛋白质工程 对蛋白质的改造，最终通过基因来完成。 蛋白质工程与基因工程的联系 基因工程只能产生自然界已存在的蛋白质 蛋白质工程可以制造新的蛋白质 10石景山一模31）（18分） 下图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。 请据图回答问题： （1）步骤①和②中常用的工具酶是