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* * 第五章 基因的分离与鉴定 基因的分离与鉴定方法 真核生物基因克隆的实例 染色体自主复制顺序的分离与鉴定 着丝粒DNA的分离与鉴定 端粒DNA的分离与鉴定? 第一节 基因的分离与鉴定方法 ?一．获得基因的一般方法 1. 化学合成方法 主要用于较小基因的合成，或需改变密码子的基因。 2. 半化学合成法 mRNA → cDNA → 加人工接头或合成一段DNA → 与载体相连 3. 筛选法 用于各种方法从基因组文库或cDNA文库中选择目的基因。 二．基因的筛选方法 1. 遗传互补法 1)??原理 当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性状的遗传基因。 i. 营养缺陷型受体细胞+外源DNA → 转化细胞涂布在合成培养基上 → 原养型细胞生长 ii. 受体细胞（无某种表型）+ 外源DNA → 转化细胞涂布在特殊培养基上 → 具有新性状细胞 iii. 虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转入目的基因后，该细胞可过量产生此酶活性，这亦可用 实例：基因组文库DNA → 转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-）→ 转化细胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因 基因组文库DNA →转化E.coli（无纤维素酶活性）→ 转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈 →纤维素酶基因 优点：简便，快速，可靠，是首选方法。获得的基因一定是完整基因。 缺点：适用范围较窄。 必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。 于基因筛选。如酿酒酵母的MFα基因就是如此筛选到的。 2) 分离步骤 分离基因组文库重组DNA分子 → 转化适当宿主细胞 → 涂布在选择培养基上→随机挑选阳性克隆，分离重组DNA分子 →再转化相同受体细胞 → 高频转化子 →基因的进一步证实和鉴定 ? 重组DNA转化细胞 SDS→出现新蛋白质带 原载体转化细胞(一) 分别制备无细胞抽提物 酶活测定→酶活性出现 非转化细胞（二） 免疫分析→与特定抗原反应 鉴定工作包括：限制酶图谱，基因定位，Southern杂交, 序列测定 2．核酸杂交法 1)原理 利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交的特点分离目的基因（同源序列不是完全相同序列） 优点：不需要基因表达 必备条件：合适的核酸探针或有关资料，外源DNA能在宿主细胞中扩增 2)核酸探针种类 i. DNA探针: 分离自某一种生物 ii.寡核苷酸探针: 根据目的基因编码蛋白质的部分氨基酸序列推测 如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala 六肽 QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN 对应mRNA N：ACGT/U CAN-AAP-GTP-CTP-CG 探针序列 Q：CT/U P：AG 32种14聚体混合物，其中必有一种14聚体与待测DNA完全互补 * 选择的肽段中氨基酸的简并密码子应最少。 **这种探针最好用于目的cDNA分离。若用于分离基因，要事先考虑到此探针序列横跨内含子序列的可能。 ***此种探针亦可根据其他来源相同基因的保守序列设计。 iii. cDNA探针: 利用特异性 mRNA反转录而成，亦可用不同mRNA 混合物反转录而成 iv. PCR探针 v. RNA探针: 由T3或T7启动子和相应聚合酶转录其下游基因片段而得 3) 分离步骤 基因(基因组或cDNA)文库 →制备DNA样品膜→与标记探针杂交 →杂交斑点（阳性克隆）→分离重组DNA分子 → 作斑点杂交?阳性克隆?Southern杂交以确认杂交结果 → DNA进一步证实和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级结构比较；分离插入片段进行基因表达，用免疫方法或其他方法检测表达产物 3. 免疫法 1) 原理 外源DNA引人宿主细胞后表达出蛋白质，以此为抗原与相应的抗体发生免疫反应, 然后利用二抗与一抗反应，用二抗偶联的酶反应筛选目的DNA 优点：不依赖于基因表达产物的生物学活性,只要抗原决定序列能被正确表达。 * 外源DNA可以是一个完整编码区