DNA序列多态性常用检测技术.ppt

第六章 DNA 序列多态性 人类基因组DNA序列差异是个体间最本质的差异。 在特定基因座位，不同个体、不同等位基因之间由碱基序列差异构成的DNA多态性称为 DNA 序列多态性 (sequence polymorphism)。 同一个体不同组织、器官的细胞中基 因组DNA序列一致，是法医学个体识别鉴定的基本前提。 DNA 序列多态性常用检测技术： 1）序列测定 2）斑点杂交技术 3）PCR-RFLP技术 4）序列特异性PCR技术 5）其他：SSCP, MVR-PCR 新技术：DNA芯片技术 DHPLC技术 MALDI-TOF-MS技术 DNA 序列测定 DNA序列测定(DNA sequencing) 是对 DNA分子一级结构的分析。从多态性的概念分 析，序列测定的靶位点碱基种类，实质是SNP：在 特定的染色体、特定的靶位点上，不同个体、不同 等位基因的碱基种类。 一、双脱氧核苷酸 链终止法测定原理 经典的核酸序列测定方法有： Sanger 双脱氧核苷酸链终止法 Maxam化学降解法 DNA复制的基本条件： ▲单链DNA模板 ▲DNA聚合酶 ▲寡核苷酸引物 ▲dNTP合成原料 基本过程： 1）引物与模板退火形成双链区。 2）DNA聚合酶结合并启动引物延伸。 3）dNTP按照碱基配对原则逐个连接在引物的3’端，以5’→3’方向延伸合成一与模板互补的DNA新生链。 1.DNA聚合酶与模板结合，在模板链上移动方向：由模板的3’→5’；引物延伸方向是5’→3’。 2.dNTP按照碱基配对原则，连接在引物3’末端。 3.新合成链碱基与模板对应碱基间以氢键连接；连接引物末端与新连接的碱基之间是磷酸二酯键。 磷酸酯键 连接 在DNA合成体系中如果加入2’，3’-ddNTP，当ddNTP按照碱基互补原则连接到引物3’端，该最后一个碱基没有3’-OH ，无法连接后续的dNTP，使该引物链终止在这个碱基位置上，不再延伸。 由于反应体系中还加有dNTP，与ddNTP形成竞争状态。引物末端连接有dNTP者，可以继续延伸。最后DNA合成的产物是一系列具有不同ddNTP终端的新合成DNA链。 例如，在反应体系中加dCTP和ddCTP： 设置一套四组反应体系：A，T，G，C： 每组除正常反应需要的dNTP外，分别加入：ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP。 复制产物经过电泳后，直接银染显带，或采用同位素标记放射性自显影，或者四组引物分别用4种荧光染料标记。 经过DNA合成反应后，由ddNTP终止的不同长度的新生DNA片段。然后分四泳道分离。检测被终止DNA片段长度并确定碱基种类，可以直接读出DNA序列。 自动循环测序技术： 利用PCR技术，以靶片段为测序模板，反应体系中同时加入有dNTP和ddNTP，PCR产物是不同长度的被终止片段。 标记方式：多采用：Dye-terminators。如果4种ddNTP分别 标记不同的荧光： (例如：A-绿、C-红、G-蓝、T-黄) 荧光染料基团标记的 基本特点： ▲激光诱发吸收光谱在可见光范围。 ▲不影响引物延伸反应。 ▲不影响标记后DNA片段的电泳性质。 ▲4种荧光的吸收和激发波长有足够的差异。 四组反应安排在同一管中进行。循环测序只需要一条引物，模板DNA以线性方式扩增，引物延伸分子以不同碱基对应位置终止的片段。 电泳技术的检测灵敏度要求高，必须能够区分相差一个碱基对的DNA片段。 毛细管电泳自动检测目前是常规检测技术 读序原则与依据：▲荧光波长（颜色)，判定引物链终止在哪一种核苷酸，▲由DNA片段电泳通过激光检测窗口的即时时间判定片段长度。 从电泳图谱可以直接读出模板的碱基序列。 二 等位基因特异性探针杂交技术 Allelic specific oligonucleotide (PCR-ASO