云斑尖塘鳢微卫星分子标记的筛选与检测.doc

云斑尖塘鳢微卫星分子标记的筛选与检测 李恩军，吴文平，钟海峰，骆剑* （海南大学海洋学院水产养殖学系，海南 海口 570228） 摘要：采用磁珠富集法分离云斑尖塘鳢的微卫星序列。从所获得的1032个克隆中筛选出146个阳性克隆，经测序81个含有微卫星序列，其中43个重复次数在10个以上。52个为完美型,27个为非完美型，2个为复合型。获得的云斑尖塘鳢微卫星序列中除CA重复单元和GA重复单元外，还有TAC等其它类型的重复单元。设计合成38对微卫星引物，其中29对引物可稳定扩增出条带，使用这些引物对云斑尖塘鳢48个个体进行检测显示：观测杂合度Ho平均值为0.63；期望杂合度He平均值为0.43。其中1对引物表现为单态，7对表现为高度多态，14对表现为中度多态，7对表现为低度多态，多态性较为丰富，绝大部分分子标记较为理想。 关键词：云斑尖塘鳢；微卫星分子标记；磁珠富集法 云斑尖塘鳢（Oxyeleotris marmoratus）原产于东南亚，隶属于鲈形目（Prciformes）、虾虎鱼亚目(Gobicidei) 、塘鳢科((Eleotridae) 、尖塘鳢属(Oxyeleotris) [ 1 ]，英文名称为Marble goby，国内俗称泰国笋壳鱼。云斑尖塘鳢是泰国、越南、马来西亚、印尼等国主要名贵淡水鱼产品，市场售价在每公斤12美元以上[ 2 ]。由于云斑尖塘醴肉质鲜美，逐渐受到我国东南沿海地区消费者的青睐[ 3 ]，目前国内市场供不应求，大宗价格已达150元/公斤；而且其易于饲养和捕捞 [ 4]，具有非常好的养殖推广前景。我国自1986年引进泰国云斑尖塘鳢以来，已经完成了全套养殖技术及人工繁殖技术[ 5-6 ]，实现了自主繁殖与养殖。由于缺乏野生资源补充亲本群体，云斑尖塘鳢出现了小群体繁育常见的种质退化问题，导致养殖性能的降低。因此，选育出优良品系是解决其种质退化问题的关键，而采用分子标记辅助育种的手段无疑能提高传统育种的效率。 目前，国内外对云斑尖塘鳢相关研究主要集中在生态学和养殖技术等方面[ 7-10 ]，在分子遗传学方面的工作主要是对尖塘鳢属鱼类线粒体12SrDNA（李春枝等，2006）[ 11 ]、16SrDNA（王茜等，2009）[ 12 ]基因序列的基础分析研究。微卫星DNA分子标记被认为是水产动物育种领域最有效和最现实的分子辅助育种标记手段，为了该鱼养殖业的可持续发展，必须培育优良品系。本研究采用快速高效的微卫星片段富集技术 [ 13-14 ]，进行云斑尖塘鳢的微卫星开发，以期用于尖塘鳢属种群遗传多样性分析、种间差异研究、种群亲缘关系及亲子代关系鉴定及遗传育种等方面。 1 材料与方法 1.1 材料 实验材料由海南断山渔业有限公司提供云斑尖塘鳢尾鳍样本48个，活体剪取尾鳍保存于无水乙醇中，-20℃长期保存。 T4 DNA 连接酶、Bsp143 I内切酶购自Fermentas公司，磁珠购自Promega公司，PMD18-T载体购自Takara公司，大肠杆菌 (Escherichia coli) DH5α感受态细胞购自天根生化科技公司，实验所用生物素标记探针、接头及引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 接头的制备：等比例的混合两组寡聚核苷酸链A和B，使每组的终浓度为200μmol/L，95℃下变性10min，然后经过4小时缓慢冷却至10℃，最终行成的双链接头为： 　　L inkerA　5’GATCGTCGACGGTACCGAATTCT; 　 L inker B 3’CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG。 生物素标记探针:5′Biotin-(CA)15-3′OH,5′Biotin-(GA)15-3′OH 1.2 方法 采用改进的FIASCO法筛选微卫星标记，基因组 DNA 提取 → DNA 酶切 → 切胶回收 → 连接接头 → PCRI → 磁珠富集 → PCR II → 连T载体、克隆 → 同位素二次杂交。 1.2.1 基因组DNA的提取 样品总 DNA 的提取采用标准的酚/氯仿抽提法加以改进，溶解过夜后取2 μl 在 1%琼脂糖凝胶上电泳检测DNA的质量，并用核酸蛋白仪测其浓度，-20℃保存待用。 1.2.2 文库的构建与阳性克隆的筛选 用限制性内切酶Bsp143I对基因组DNA进行消化后，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，并用DNA 胶回收试剂盒回收 400—1000bp DNA 片段，回收片段连接接头AB后进行PCR扩增。反应程序为：94℃5min；94℃30s，65℃45s，72℃1min，20个循环；72℃5 min。 扩增产物纯化后用磁珠进行杂交洗脱，以DNA洗脱液为模板进行二次PCR，PCR产物用天跟试剂盒回收。 回