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作者姓名：张丽萍 专业名称：动物营养与饲料科学 指导教师：王康宁 论文题目：不同品种猪肠道微生物与体脂、ANGPTL4基因关系的研究 作者简介： 摘 要 本研究以实时荧光定量PCR和原代培养猪回肠上皮细胞技术，研究了不同品种猪肠道微生物与体脂、ANGPTL4基因的关系。研究包括六个试验。 试验一：猪拟杆菌属和普雷沃氏菌属16SrDNATagMan-PCR实时荧光定量PCR方法建立 通过对猪肠道30种细菌的16SrDNA序列进行比对分析，设计拟杆菌属—普雷沃氏菌属荧光定量的特异引物；以多形拟杆菌菌株（CDC1404-A）基因组的DNA为模板，用常规PCR引物扩增16SrDNA靶片断，将PCR产物纯化后作为DNA标准品，按1.19×102－1.19×106copies/ul5个稀释梯度的标准品作模板，建立定量标准曲线；用TaqMan探针建立25ul反映体系，对不同浓度的多形拟杆菌DNA样品进行检测，检测探针的敏感性；并以乳酸杆菌、大肠杆菌和双歧杆菌的基因组DNA模板作阴性对照，检测拟杆菌属—普雷沃氏菌属的特异性。结果表明： 1）通过克隆测序，得到了拟杆菌属和普雷沃氏菌属细菌的16SrDNA部分共有片段序列，该序列与Genbank中发表的多形拟杆菌（基因序列号为M58763）和中间普雷沃菌AY323522）16SrDNA基因序列相比，该片段为多形拟杆菌的792～1003普雷沃菌位碱基的片段μM,Taqman探针敏感性为3.73个／ul； 3）本试验所制作的标准品稀释度在1.19×102－1.19×106copies/ul范围线性关系好,标准品可用于后续试验的研究。 试验二：不同品种猪肠道微生物与体脂的关系 试验通过选用在同一条件下饲养的0、1、2、3、4和5月龄的长白和太湖猪各4头，屠宰取后回肠和盲肠内容物,检测1、3和5月龄长白和太湖猪回肠和盲肠内容物的总细菌、革蓝氏阳性细菌(G+)、革蓝氏阴性细菌(G-)、革蓝氏阳性细菌/革蓝氏阴性细菌(G+/G-)、拟杆菌属-普雷沃氏菌属（Bacteroides–Prevotella,B.P）TaqMan-PCR检测方法的建立 为了对ANGPTL4基因进行更为准确定量,本研究首先克隆长白和太湖猪的ANGPTL4和β-actin的DNA序列。根据所测定的序列，分别设计引物和探针,以回肠基因组的cDNA为模板，用常规PCR引物扩增，将PCR产物纯化作为DNA标准品，ANGPTL4和β-actin基因标准品分别按1.37×104－1.37×109和8.31×105－8.31×1010copies/mL的稀释梯度建立定量标准曲线，以TaqMan探针建立25ul反映体系，优化探针的最佳工作浓度，并检测探针的灵敏度。结果表明： 1）应用克隆测序方法获得了长白和太湖猪的目的基因ANGPTL4和内参基因β-actin的部分序列,所获得的长白和太湖猪的ANGPTL4的片断与参照序列（AY751522）的同源性分别为98%和92%，而β-actin与参照序列（U07786）的同源性都为98%。 2）目的基因ANGPTL4和内参基因β-actin的FQ-PCR引物及特异设计探针正确。 3）ANGPTL4和β-actin探针在25ul体系中的最佳工作浓度分别为0.35μM和0.40μM,探针的灵敏度分别为13.7和83.1拷贝/ul； 4）所构建的ANGPTL4和β-actin的标准曲线良好，反映体系中分别含有 1.37×104－1.37×109和8.31×105－8.31×1010copies/mL时，扩增反映ct值与拷贝数的对数呈线性关系，所得标准品可以用于后续试验。 试验四 ANGPTL4基因猪不同组织器官中的表达差异 试验通过选用在同一条件下饲养的4月龄长白和太湖猪各4头，屠宰后取肝脂肪0日龄健康正常的太湖猪和长白猪各24头进行150天的试验。每个品种设为一个处理，每个处理按体重一致原则设4个重复，公母各半,每个重复6头猪。在同一环境条件下饲予相同的饲粮，分别在0、1、2、3、4、5月龄，每种猪各屠宰4头，测定回肠中ANGPTL4基因表达量和拟杆菌属-普雷沃氏菌属细菌数量。结果表明： 1）1-5月龄的太湖猪回肠拟杆菌属-普雷沃氏菌属数量均高于长白猪,特别是在2、3和5月龄，极显著(p0.01)高于长白猪。两品种猪的拟杆菌属-普雷沃氏菌属数量，都是随着年龄增加，呈现先增加，2月龄下降，然后再上升的规律。 2）1-5月龄太湖猪回肠ANGPTL4基因表达量均低于长白猪，特别是在1、2和5月龄极显著（p〈0.01）低于长白猪，但在0日龄与长白猪的差异不显著（p0.05）;两品种猪ANGPTL4基因表达量与拟杆菌属-普雷沃氏菌属的变化成相反趋势，即先下降，后增加，再下降。 3）猪回肠拟杆菌、G-数量都与回肠ANGPTL