免疫墨点法.ppt

南方點墨法 1.檢測基因組內特定DNA序列 2.方法是自DNA自細胞中萃取出來，將之切成片段後，以膠體電泳將各片段分離、失活後再沾到NC paper(硝基纖維紙)濾片上，在適合接附的條件下，與具有放射性的探針一起反應，再以自動放射性顯影法來偵測探針與RNA是否有形成配對情形 3.單股DNA或RNA的雜交作用：在低溫、高鹽 北方點墨法 1.檢測RNA特定序列的技術 2.北方點墨法的實驗方法與南方點墨法類似，唯一不同在於北方點墨法是以探針來偵測RNA分子內是否含某特定序列 3.方法 (1)將細胞內之total RNA萃取出來，利用膠體電泳分離後，將之轉移至硝基纖維紙上 (2)將結合在濾紙上的RNA與有標定的探針進行雜合作用，若樣品RNA中含有與探針互補之序列，則探針會與結合 西方點墨法 1.鑑定蛋白質內是否含特定序列 2.所使用的探針為有標定特殊物質的抗體，因為抗體可專一性地與抗原分子結合 3.程序 (1)利用高熱使蛋白質分子變性 (2)利用膠體電泳將蛋白質依其個別的分子量分離開來 (3)分開的蛋白質至硝基纖維紙上 (4)將鍵結有蛋白質的硝基纖維紙與含有標定特殊物質的抗體溶液作用 (5)此Ab可辨識並鍵結至特殊蛋白直上(探針：標定特殊物質的Ab) (6)將可辨識前述特定抗體的二級抗體與之作用，及可鑑定出有含特定胺基酸的蛋白質 墨點法簡介 Southern Blotting Northern blotting Western blotting 報告人 南台科技大學碩專班一甲 吳建勝 學 號 NACH0010 Blotting techniques墨漬(印跡)技術 ?Blotting techniques即為墨漬技術是一種用來分析細胞內微小分子如DNA、RNA和蛋白質之技術，在這種技術之中，所用到的原理主要是互補法則和雜交。? 目前所用的墨漬技術 主要有三種分別為南方墨點法、北方墨點法和西方墨點法 各墨漬技術的說明如下：?????? ?a. Southern Blotting 南方墨點法 為一種常用的操作技術，DNA片段先藉由瓊脂糖凝膠電泳分開，然後藉由〝墨漬〞法將之轉移到一個硝酸纖維素濾膜上，以便隨後採用放射性標記核酸探針與之雜交，以便對感興趣的核酸序列進行鑑定或是分析。? b. Northern Blotting 北方墨點法 主要是將凝膠電泳分離的RNA，轉移到適宜的介質之中，用放射性探針雜交，以對所要研究的RNA進行鑑定和分離的技術。? c. Western Blotting 西方墨點法或稱蛋白墨點法 其主要是將電泳分離後所獲得的蛋白質譜帶，轉移到另一種介質的技術，轉移後可供進一步分析之用。? 南方墨點法（Southern blot） 南方墨點法（Southern blot）是由英國生物學家Sir Edwin Southern發明，並因此得名（Southern為南方之意），是一種十分常用的分子生物學實驗技術。其用途是利用基因探針去偵測由膠體電泳分離出來的DNA片段，以搜尋到含有特定序列的DNA片段。 基本原理 Southern雜交是利用標記的探針（probe）與轉印膜上靶DNA片段進行雜交的技術，檢測靶DNA片段中是否存在與探針同源的序列。雜交過程是高度特異性的,可以根據所使用的探針(序列已知)進行特異性的靶序列檢測。 雜交探針（Hybridization probe） 雜交探針是一小段單鏈DNA片段（十幾到幾百個鹼基），用於檢測與其互補的核酸序列。雙鏈DNA加熱變性成爲單鏈，隨後用放射性同位素（通常用32P）、螢光染料或者酶（如辣根過氧化物酶）標記成爲探針。32P通常被摻入組成DNA的四種核苷酸之一的磷酸基團中，而螢光染料和酶與核酸序列以共價鍵相連。 當將探針與樣品雜交時，探針和與其互補的核酸（DNA或RNA）序列通過氫鍵緊密相連，隨後，未被雜交的多餘探針被洗去。最後，根據探針的種類，可進行放射自顯影、螢光顯微鏡、酶聯放大等方法來判斷樣品中是否，或者何位置含有被測序列（即與探針互補的序列）。 Southern blot的基本過程 1從細胞或組織中用酚/氯仿反覆抽提蛋白質並用無水乙醇沉澱的方法製備基因組DNA(gDNA)； 2限制性酶切基因組DNA； 3將酶切產物電泳分離(electrophoretic separation)； 4毛細轉印或電轉印並固定於NC膜或尼龍膜上； 5在膜上與標記探針雜交； 6洗膜後可觀察雜交結果。 1從細胞或組織中用酚/氯仿反覆抽提蛋白質並用無水乙醇沉澱的方法製備基因組DNA(gDNA)； 2限制性酶切基因組DNA； 3將酶切產物電泳分離(electrophoretic separation)； 4毛細轉印或電轉印並固定於NC膜或尼龍膜上； 5在膜上與標記探針雜交； 6