转基因植物的遗传特性与表达调控.ppt

* 转基因植物的遗传特性与表达调控 一、转基因植物中外源DNA的整合特性 1、外源DNA的整合位点和拷贝数 （1）整合位点：转基因导入植物细胞后，通过细胞分裂时遗传物质的复制过程整合到核基因组中，目前普遍认为，转基因在寄主染色体内的整合位点是随机的, 外源DNA可以插入植物基因组的任何一条染色体，也可以插入一条染色体的任何位点或没有固定的插入位点，但往往对转录活跃区域具有优先插入特性。 （2）整合拷贝数：许多研究表明，外源DNA的插入拷贝数有以下几种：单拷贝单位点插入；串联多拷贝单位点插入；多拷贝多位点插入，多数情况是以单拷贝在单位点整合，但在同一位点，也存在较多的多个拷贝串联整合的情况。形式为头对尾式串联和头对头式串联。农杆菌转化和基因直接转化整合拷贝数存在差异，前者拷贝数少，整合位点特异性强。 2、外源DNA结构对整合的影响 外源DNA结构分为四种类型：单链线形DNA、单链环形DNA、双链线性DNA及双链环形DNA。四种结构中单链线状DNA研究较多，一般认为单链DNA可以通过有效的不正常整合参与同源染色体序列的重组，研究认为单链DNA在单链完全变成双链之前已发生重组。此外Bilang等（1992）研究了导入烟草的DNA结构（线形和环形）的重组效率，结果表明线性单链DNA同环形单链DNA相比，其抗性愈伤组织数目要高于后者，说明线性DNA的整合效率要高于环形DNA。 3、转化后整合位点的DNA结构变化 保持整合外源基因的完整性是实现转基因功能表达的基本条件，外源基因整合后的完整性与其结构变化有关，现已明确，外源基因作为侵入者的整合，会引起不同程度的基因重排，涉及缺失、异位、倒位及重复等一系列现象。这主要与细胞本身的重复和修复功能有关。 Mayerhofer等（1991）和Gheysen等（1991）对15个独立的T-DNA插入进行了研究，提出了外源DNA整合模型， 他们认为： （1）T-DNA的插入不会引起植物DNA大的重排，但在T-DNA的两侧各出现了一个158bp的正向重复序列，且多数插入会导致靶位点处小的缺失，最多79个核苷酸； （2）在T-DNA和植物DNA连接处常有几个至33个核苷酸的填充DNA，这些填充序列与靠近连接处的植物DNA序列相似； （3）在靶位点处不要求有特异的序列，但若T-DNA两端与植物靶位点之间有一段短序列（5-10bp）同源，则可能对T-DNA整合进植物基因组其作用。 此外，插入植物染色体的外源DNA大小是有限制的，如油菜插入外源DNA为5-6Kb，烟草中最大可达9Kb，但频率较低。 4、转化方法对整合外源基因结构的影响 尽管转化方法较多，但外源DNA以两种分子形式转化，一种是外源DNA插入T-DNA质粒载体中导入；另一种是裸露的DNA分子直接导入，由于转化原理不同，因此与整合后的外源DNA结构必然存在直接关系。 （1）T-DNA转化的外源DNA结构变化 农杆菌介导转化细胞中T-DNA结构完整，整合位点稳定，多数情况下在25bp处与植物DNA连接，整合后的外源基因结构变异少，但外源DNA也会出现结构变化，表现为T-DNA的串联和截短现象。 T-DNA串联：通常有5-20个拷贝的T-DNA的首尾相联，在大多数整合事件中，T-DNA可以在无选择压的情况下串联起来。 T-DNA截短：也是T-DNA转化时较多发生的结构变化，可能是由于T-DNA两侧各有一个25bp的边界类似序列。截短是在转移和整合过程中产生，由于T-DNA区内‘框类似’序列的存在，被用作引导T-DNA转移和整合的次级识别位点，从而代替正常情况下的25bp右边界序列，所以正常的有边界序列被截短。 截短在共整合载体中比二元载体系统更易发生。 （2）裸露DNA直接转化的外源DNA结构变化 采用裸露DNA直接转化时，整合的外源DNA往往出现复杂的杂交图谱，在转化当代及子代中常出现DNA环化、甲基化、片段分离和丢失等现象。 在DNA直接转化中供体DNA容易在整合过程中发生各种结构变化和修饰，而且植物靶DNA序列也可在供体DNA整合过程中发生重排。 5、位点特异重组 （1）位点特异性重组系统 遗传重组分为3类：同源重组，转座和位点特异性重组，也称定位重组。同源重组发生在两个具有一定程度同源性的DNA分子之间或同一分子的两个同源性区域，它们相互重组。转座和位点特异重组的共同点是重组只发生于具有特定的DNA序列的位置上，由特定的酶来识别某一种DNA序列，而造成重排。二者的区别在于转座重组中，识别位点之间的DNA片段被转位插入到另外的位点，是DNA合成过程中伴随而发生的DNA断裂、转移和插入。而定位重组并不涉及DNA的净合成，在两个识别位