链霉素诱变育种的方案.ppt

菌种的纯化： 1、土壤用无菌水浸泡，静置取上清 2、做梯度——上清分别稀释10倍、100倍、1000倍等等 3、使用链霉菌优势培养基（在上边链霉菌比其他菌长的快），用步骤2的各个梯度液体分别铺板。 4、按照链霉菌最适生长温度培养。 5、选取菌落数在100个左右，菌落清晰无重叠的平板。 6、根据伯杰氏菌种鉴定手册中链霉菌的菌落外观介绍，粗选出基本符合的链霉菌。 链霉菌单孢子悬液的制备： 所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液，将121℃灭菌２０－３０ｍｉｎ的无菌水加入到培养有链霉菌斜面的试管中，用接种环轻轻刮下孢子，(所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液），将含有孢子的无菌水转入三角瓶中，加入玻璃珠，在摇床上打碎，经滤膜过滤后即得到单孢子率在98％以上的单孢子悬液。 选择该出发菌株的原因如下： ①对诱变剂的敏感性高； ②具有特定生产性状的能力或潜力； ③可采用划线分离法和稀释分离法进行纯化； ④该菌株变异幅度广； ⑤该菌株稳定性较好。 （二）、诱变剂的选择及诱变剂量的选择 选择物理诱变剂中非电离辐射即紫外线。 因为紫外线是一种使用时间长、效果好、设备简单、值得推广的诱变剂，大约有80%的高产抗生素产生菌都曾经用过紫外线这一诱变方法。 紫外线的诱变育种 紫外线的作用机制是使两个嘧啶之间聚合，形成嘧啶二聚体，碱基不能正常配对。 最适诱变剂量的选择 在诱变育种中有两条重要的实验曲线: ①剂量-存活率曲线 ②剂量-诱变率曲线 通过比较以上两曲线，可找到剂量-存活率-诱变率三者的最佳结合点。在实际工作中，突变率往往随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量反而会使突变率降低。根据UV、X射线和乙烯亚胺 紫外线诱变的操作步骤： 1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，加入无菌生理盐水洗涤再离心。 2．将菌悬液放入巳灭菌的装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液通过滤纸过滤，单细胞滤液装入试管内，使细胞数约为108个／ml，作为待处理菌悬液。 3．取2～4ml制备的菌液加到直径7cm培养皿内，放入 4．取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。 6．取中间培养液稀释分离、培养。 7．挑取菌落进行筛选。 （三）、影响诱变效果的因素 （1）菌种遗传特性 各菌株因遗传特性不同，对诱变剂敏感性也不一 样。 （2）菌体细胞壁结构 丝状菌孢子壁的厚度及表面的蜡质会阻碍诱变剂渗 入细胞。 （3）环境条件的影响 环境条件的影响包括： ①诱变前预培养和诱变后培养 ②温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响 由接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，使链霉菌细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。如果划线适宜的话，能将链霉菌细胞一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。并测定出其变异率（变异数与观察总个体数的比值）。 挑出变异菌落并移植至斜面上。 分离后得到的菌落，真正能发生性能变好的所谓正突变个数极少，要从几千万个菌落中选出几个好的，与自然选育中的筛选方法相同。可分为初筛（平板筛选、摇瓶发酵筛选)和复筛。 筛选的方法：随机乱向筛选 定向筛选 突变是随机不定向的，但是筛选是定向的，培养基和培养条件是决定菌种某些特性保留或淘汰的“筛子”。 初筛：以多为主，尽量扩大筛选范围。 复筛：以质和精为主，反复多次，结合自然分离，选育高产或其他优良菌株。 多级水平筛选：由于诱变产生高产突变株的频率很低，而且实、验误差又很难避免，所以筛选工作中常用多级筛选，一利于优良菌株的获得 平板菌落预筛 根据特定代谢产物的特异性，利用琼脂平板进行筛选和活性粗测的方法，大幅度扩大有效筛选量，提高筛选工作效率。 摇瓶发酵筛选 优点：不管种子或发酵过程的生产条件、生理条件如何，都与发酵罐大生产条件相近，可以模拟进行。 对初筛出来的菌株进行复筛时，通常采用摇瓶培养法，一般一个菌株至少要重复3~5个瓶，培养后的发酵液必须采用精确分析方法测定。 复筛过程中，要结合各种培养条件进行筛选，在不同培养条件下进行试验。 1、步骤：摇瓶培养通常分为初筛和复筛，初筛因菌株多常常一株菌一瓶，进行振荡培养，培养结束后逐个进行活性测定，将生产性能高的菌株用沙土管或冷冻管保藏。复筛时