6.1-细胞免疫学技术.ppt

细胞免疫学技术 细胞免疫学技术种类 第一节 免疫细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 二、细胞分离技术 三、分离标本的保存技术 第一节 细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 （一）血液标本的采取 无菌采血，抗凝 1、机械去纤维蛋白法（玻璃珠法）采血过程中，边采边摇采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但本法简便、对淋巴细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。 2、肝素抗凝法 肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，防止血液凝固。 3、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝法 EDTA为螯合剂，可与血液中钙离子结合而抗凝。 马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血，家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏或耳静脉采血，犬由颈静脉或四肢静脉采血，豚鼠由心脏采血，小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。 第一节 细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 （二）胸腺细胞悬液的制备 【方法】 4周龄健康小鼠，体重14~16g。 （1）小鼠颈椎脱臼处死。 （2）迅速取出胸腺。置于100目钢网上。注意无菌，洗干净胸腺上的血管。 （3）轻轻研磨，制成细胞悬液。 （4）用台盼蓝染色，计数。活细胞数＞90%。 第一节 细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 （三）巨噬细胞的采取 1、人巨噬细胞的收集（斑蝥酊敷贴法） 2、小鼠腹腔巨噬细胞的制备 【方法】20-25g小白鼠 （1）小鼠颈椎脱臼处死 （2）腹部消毒，无菌注入肝素-Hanks液 （3）吸出腹腔液，洗涤，计数，调整细胞浓度 第一节 细胞的分离技术 二、细胞分离技术 （一）外周血白细胞的分离 根据人外周血红细胞与白细胞的比重不同，其沉降速度随之而异。 1、自然沉降法 利用RBC自然沉降率较快的分离法。 抗凝血于室温或37℃静置30~60分钟，血液即分成明显的3层： 上层为淡黄色血浆， 紧贴红细胞上面的灰白层为白细胞 底层为红细胞 本法所得的白细胞损伤极轻微。 第一节 细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 （一）外周血白细胞的分离 2、加速红细胞沉降法 利用高分子量的聚合物（明胶）使红细胞凝聚成串钱状，借以加速红细胞沉降，使之快速与白细胞分离。 上层富含白细胞 红细胞凝聚成串钱状沉积在底层， 本法的细胞得率比自然沉降法高，但明胶增加白细胞粘性，对实验有所影响。 第一节 细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 （二）外周血单个核细胞的分离 （PBMC） [基本原理] 根据人类各种血细胞的比重有所不同，利用一种比重介于1.075~1.092之间而接近等渗的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而得以分离各种血细胞群。 第一节 细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 （三）淋巴细胞及其亚群的分离 1、淋巴细胞的分离 ①玻器吸附法 将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内，置37℃ 30 min～40min，用毛细吸管轻轻吸取悬液，即为淋巴细胞。用适量的Hank’s液冲洗平皿，收获即为单核细胞悬液。 ②L-亮氨酸甲基酯法 单核-巨噬细胞内富含溶酶体酶，它能摄取嗜溶酶体的L-亮氨酸甲基酯，集中于溶酶体上，使该酯转化为对细胞本身有毒性的L-lencyl亮氨酸甲基酯，但不影响T、B、NK等细胞。用本法获得的淋巴细胞纯度大于99％，活力＞95％。 第一节 细胞的分离技术 一、标本的采取与保存 （三）淋巴细胞及其亚群的分离 2、淋巴细胞亚群的分离 根据表面的标志不同，建立能选择性纯化所需细胞的技术。 ①E花环试验 分离T细胞群 ②尼龙毛分离方法 分离T、B细胞 ③亲和层析原理分离淋巴细胞亚群 去除某一细胞群 ④荧光激活细胞分离仪（FACS） 最佳分离方法 磁性微球用于细胞的分离和纯化（MACS技术 ） 免疫磁性微球的分离原理 第一节 细胞的分离技术 三、分离标本的保存技术 液氮深低温（－196℃）保存技术 但降温过程由于冰晶的形成和渗透压的改变，可导致细胞的损伤和部分死亡。因此在冷冻过程要加冷冻保存剂，常用二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。 1、冷冻保存 将待冻细胞悬液加冷冻保存剂，并配成适当浓度，分装小管。采用两步降温法，即及时迅速地将其降温至一选择好的临界低温作为过渡站，如一80℃低温冰箱过夜，或放在液氮罐液面以上一层空间15~20h，然后再移放