第五讲分子克隆载体.pptVIP

基因操作的基本步骤 载 体 单独一个包括启动子、编码区和终止子的基因，或者组成基因的某个元件，一般是不易进入受体细胞的，即使采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。 载体(vector): 能携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、整合或表达的工具。 作为克隆载体的DNA分子具备的条件： 1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞； 2 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖； 3 具有由单一限制酶识别位点组成的多克隆位点(MCS）； 4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记基因； 5 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。 按功能分： 克隆载体 表达载体 质粒克隆载体 (plasmid cloning vector) 质粒的存在形式： 一般以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA)的形式存在。 也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分子(L-DNA)的形式存在。 质粒DNA的大小 质粒 宿主 大小（kb） pPbs 蓝藻 1.5 CoLE1 大肠杆菌 6.4 PV21 三叶草根瘤菌 700 多数在10kb左右 质粒的基本性质：1 复制 按照质粒控制拷贝数的程度，可以将质粒分为: 1）严谨型质粒(stringent plasmid) 拷贝数少，为1～5个 2 ）松散型质粒(relaxed plasmid) 拷贝数多，可达10个拷贝以上 某种质粒属于严谨型或是松散型的，与宿主有一定的关系。 例子：质粒ColE1-K30在大肠杆菌中属于松散型的，在奇异变形杆菌中是严谨型的。 一般来说，希望构建的质粒克隆载体是松散型的，所以在构建的克隆载体中应含有松散型的复制起始位点和调控复制拷贝数的基因。 2 质粒的不相容性(incompatibility): 两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。 亲缘关系密切的不同质粒一般属于不亲和性质粒。 野生型质粒与其衍生的重组质粒属于不亲和性质粒。 当质粒载体承载目的基因转化受体细胞时，考虑受体细胞内原有的质粒与作为克隆载体的质粒是否属于亲和性质粒。 作为受体细胞最好不含内源质粒。 3 质粒的转移性 接合型质粒 (conjugative plasmid)： 转移基因tra：指令宿主细胞产生菌毛、合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞的结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。 非接合型质粒(non-conjugative plasmid)： 顺式作用元件： bom位点 移动基因：mob基因 (分子质量小、拷贝数多、被动迁移) 构建质粒载体的基本原则 1 选择合适的出发质粒 必备元件： A 复制起始点 B 选择标记基因 C 克隆位点 D 启动子 E 终止子 等等……….. 构建质粒载体的基本原则 2 正确获得构建质粒载体克隆元件 一般用限制酶切割出发质粒DNA分子，获得含有某种元件的DNA片段。 为了获得含某种元件的DNA片段，选用的切割位点既要保证元件完整无缺，又要使DNA片段愈小愈好，尽可能不含或少含不必要的序列，使构建的载体尽可能小。 构建质粒载体的基本原则 组装合适的选择标记基因 构建供转化大肠杆菌用的质粒载体，可组装蓝/白颜色进行选择的(B-半乳糖苷酶基因)lacz’基因。 但构建供转化蓝藻用的质粒载体不能用这个基因。因为蓝藻含有大量的藻蓝蛋白。 构建质粒载体的基本原则 4 选用合适的启动子 如果用真核生物基因的启动子作为原核生物表达克隆载体的启动子，其功效下降；